Name: CRISPR-Cas9 매개 유전자 결실은 feeder-free 조건에서 배양된 인간 만능 줄기 세포에서 발생합니다. (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-11-01T14:30:00.000+00:00
Duration: 4 min 21 s
Description: 배우세요 CRISPR-Cas9을 이용한 L2HGDH 유전자 결실 방법을 인간 배아 줄기세포(H9)에서 적용하는 기술입니다. 이 연구는 다능성과 분화 능력을 유지하면서 안정적인 유전자 편집을 가능하게 합니다.

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<ol><li>Jinek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+programmable+dual-RNA-guided+DNA+endonuclease+in+adaptive+bacterial+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity.</a> Science. 337 (6096), 816-821 (2012).</li>
<li>Jiang, F., Doudna, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Cas9+structures+and+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biophys%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Cas9 structures and mechanisms.</a> Annu Rev Biophys. 46 (1), 505-529 (2017).</li>
<li>Mali, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-guided+human+genome+engineering+via+Cas9%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">RNA-guided human genome engineering via Cas9.</a> Science. 339 (6121), 823-826 (2013).</li>
<li>Xue, C., Greene, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+repair+pathway+choices+in+CRISPR-Cas9-mediated+genome+editing%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Genet%22%5BJournal%5D)">DNA repair pathway choices in CRISPR-Cas9-mediated genome editing.</a> Trends Genet. 37 (7), 639-656 (2021).</li>
<li>Zhang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR%2FCas9+genome-editing+system+in+human+stem+cells%3A+Current+status+and+future+prospects%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther+Nucleic+Acids%22%5BJournal%5D)">CRISPR/Cas9 genome-editing system in human stem cells: Current status and future prospects.</a> Mol Ther Nucleic Acids. 9, 230-241 (2017).</li>
<li>Qiu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MYC+regulation+of+D2HGDH+and+L2HGDH+influences+the+epigenome+and+epitranscriptome%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">MYC regulation of D2HGDH and L2HGDH influences the epigenome and epitranscriptome.</a> Cell Chem Biol. 27 (5), 538-550.e537 (2020).</li>
<li>Sheikh, M. A., Ansari, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lentiviral+mediated+delivery+of+shRNAs+to+hESCs+and+NPCs+using+low-cost+cationic+polymer+polyethylenimine+%28PEI%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Lentiviral mediated delivery of shRNAs to hESCs and NPCs using low-cost cationic polymer polyethylenimine (PEI).</a> J Vis Exp. (183), e63953(2022).</li>
<li>Guo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+and+cost-effective+method+for+screening+of+CRISPR%2FCas9-induced+homozygous%2Fbiallelic+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Methods%22%5BJournal%5D)">A simple and cost-effective method for screening of CRISPR/Cas9-induced homozygous/biallelic mutants.</a> Plant Methods. 14 (1), 40(2018).</li>
<li>Ardah, M. T., Parween, S., Varghese, D. S., Emerald, B. S., Ansari, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Saturated+fatty+acid+alters+embryonic+cortical+neurogenesis+through+modulation+of+gene+expression+in+neural+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Nutr+Biochem%22%5BJournal%5D)">Saturated fatty acid alters embryonic cortical neurogenesis through modulation of gene expression in neural stem cells.</a> J Nutr Biochem. 62, 230-246 (2018).</li>
<li>Parween, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Higher+O-GlcNAc+levels+are+associated+with+defects+in+progenitor+proliferation+and+premature+neuronal+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Higher O-GlcNAc levels are associated with defects in progenitor proliferation and premature neuronal differentiation.</a> Front Cell Neurosci. 11, 415(2017).</li>
<li>Parween, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nutrient-sensitive+protein+O-GlcNAcylation+modulates+the+transcriptome+through+epigenetic+mechanisms+during+embryonic+neurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Life+Sci+Alliance%22%5BJournal%5D)">Nutrient-sensitive protein O-GlcNAcylation modulates the transcriptome through epigenetic mechanisms during embryonic neurogenesis.</a> Life Sci Alliance. 5 (8), e202201385(2022).</li>
<li>Varghese, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+modeling+of+hepatogenesis+using+obese+iPSCs-hepatocyte+differentiation+uncovers+pathological+features%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Dis%22%5BJournal%5D)">Developmental modeling of hepatogenesis using obese iPSCs-hepatocyte differentiation uncovers pathological features.</a> Cell Death Dis. 13 (7), 670(2022).</li>
<li>Varghese, D. S., Alawathugoda, T. T., Ansari, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fine-tuning+of+hepatocyte+differentiation+from+human+embryonic+stem+cells%3A+Growth+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Int%22%5BJournal%5D)">Fine-tuning of hepatocyte differentiation from human embryonic stem cells: Growth factor.</a> Stem Cells Int. 2019 (5), 5968236(2019).</li>
<li>Jacobs, E. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR%2FCas9-mediated+genome+editing+in+na%C3%AFve+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">CRISPR/Cas9-mediated genome editing in naïve human embryonic stem cells.</a> Sci Rep. 7 (1), 16650(2017).</li>
<li>Cuevas-Ocaña, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cell-based+optimized+approach+for+rapid+and+efficient+gene+editing+of+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">A cell-based optimized approach for rapid and efficient gene editing of human pluripotent stem cells.</a> Int J Mol Sci. 24 (3), 12345(2023).</li>
<li>Veres, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low+incidence+of+off-target+mutations+in+individual+CRISPR-Cas9+and+TALEN-targeted+human+stem+cell+clones+detected+by+whole-genome+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Low incidence of off-target mutations in individual CRISPR-Cas9 and TALEN-targeted human stem cell clones detected by whole-genome sequencing.</a> Cell Stem Cell. 15 (1), 27-30 (2014).</li>
<li>Smith, C., Gore, A., Yan, W., Abalde-Atristain, L., Li, Z., He, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-genome+sequencing+analysis+reveals+high+specificity+of+CRISPR%2FCas9+and+TALEN-based+genome+editing+in+human+iPSCs%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Whole-genome sequencing analysis reveals high specificity of CRISPR/Cas9 and TALEN-based genome editing in human iPSCs.</a> Cell Stem Cell. 15 (1), 12-13 (2014).</li>
<li>Zhang, X. H., Tee, L. Y., Wang, X. G., Huang, Q. S., Yang, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Off-target+effects+in+CRISPR%2FCas9-mediated+genome+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther+Nucleic+Acids%22%5BJournal%5D)">Off-target effects in CRISPR/Cas9-mediated genome engineering.</a> Mol Ther Nucleic Acids. 4 (7), e264(2015).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>2-메르캅토에탄올&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>31350010</td><td></td></tr><tr><td>38.5 mL, 멸균 + 인증 무료 오픈탑 Thinwall Ultra-Clear Tubes</td><td>Beckman Coulter</td><td>C14292</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Stem cell Technologies</td><td>7920</td><td></td></tr><tr><td>bFGF 재조합 인간</td><td>Invitrogen</td><td>PHG0261</td><td></td></tr><tr><td>Brachyury Rabbit mAb</td><td>Abclonal</td><td>A5078</td><td></td></tr><tr><td>BsmBI-v2</td><td>NEB</td><td>R0739S</td><td></td></tr><tr><td>chir99021</td><td>Tocris</td><td>4423/10</td><td></td></tr><tr><td>Corning Matrigel 기저막 매트릭스, LDEV-free</td><td>Corning</td><td>354234</td><td></td></tr><tr><td>Cyclopamine</td><td>줄기세포 기술</td><td>72074</td><td></td></tr><tr><td>DMEM 미디어</td><td>Invitrogen</td><td>11995073</td><td></td></tr><tr><td>DMEM 영양 혼합물 F12&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>11320033</td><td></td></tr><tr><td>DPBS w/o: Ca 및</td><td>Mg PAN Biotech</td><td>P04-36500</td><td></td></tr><tr><td>태아 bovie 혈청</td><td>Invitrogen</td><td>10270106</td><td></td></tr><tr><td>FoxA2/HNF3&beta; &nbsp;</td><td>CST</td><td>8186</td><td></td></tr><tr><td>GAPDH (14C10) Rabbit mAb 항체</td><td>CST</td><td>2118S</td><td></td></tr><tr><td>Gentle Cell Dissociation 시약</td><td>줄기세포 기술</td><td>7174</td><td></td></tr><tr><td>HyClone Non Essential Amino Acids (NEAA) 100x Solution</td><td>GE healthcare</td><td>SH30238.01</td><td></td></tr><tr><td>Ki-67 (D3B5) Rabbit mAb</td><td>CST</td><td>9129</td><td></td></tr><tr><td>KnockOut Serum Replacement</td><td>인비트로젠</td><td>10828028</td><td></td></tr><tr><td>L 글루타민, 100x</td><td>인비트로젠</td><td>2924190090</td><td></td></tr><tr><td>L2H-BMSBSP-F1</td><td>마크로젠</td><td></td><td>CGTGCGGGTTCGCGTCTGGG</td></tr><tr><td>L2HGDH 다클론 항체</td><td>Proteintech</td><td>15707-1-AP</td><td></td></tr><tr><td>L2HGDH-SgRNA1-F</td><td>마크로젠</td><td></td><td>CACCGCGTGCGG GTTCGCGTCTGGG</td></tr><tr><td>L2HGDH-SgRNA1-R</td><td>마크로젠</td><td></td><td>AAACCCCAGACGC GAACCCGCACGC</td></tr><tr><td>L2HGDH-SgRNA2-F</td><td>마크로젠</td><td></td><td>CACCGCCCGCGG GCTTTTCGCCGG</td></tr><tr><td>L2HGDH-SgRNA2-R</td><td>마크로젠</td><td></td><td>AAACCCGGCGAA AAGCCCGCGGGC</td></tr><tr><td>L2H-SeqF1</td><td>마크로젠</td><td></td><td>GCTAAAGAGCGC GGGTCCTCGG</td></tr><tr><td>L2H-SeqR1</td><td>마크로젠</td><td></td><td>GTGGACGGGTTG TTCAAAGCCAGAG</td></tr><tr><td>L2H-UMSBSP-R1</td><td>Macrogen</td><td></td><td>GTGGACGGGTTG TTCAAAGCCAGAG</td></tr><tr><td>LentiCRISPRv2</td><td>Addgene</td><td>52961</td><td></td></tr><tr><td>mTesR1 complete</td><td>media 줄기세포 기술</td><td>85850</td><td></td></tr><tr><td>Nanog 항체</td><td>CST</td><td>3580</td><td></td></tr><tr><td>NEUROBASAL MEDIUM 1x CTS</td><td>Invitrogen</td><td>A1371201</td><td></td></tr><tr><td>Neuropan 2 보충제 100x</td><td>PAN Biotech</td><td>P07-11050</td><td></td></tr><tr><td>Neuropan 27 보충제 50x</td><td>PAN Biotech</td><td>P07-07200</td><td></td></tr><tr><td>Oct-4 항체</td><td>CST</td><td>2750</td><td></td></tr><tr><td>Pax6 (D3A9V) XP Rabbit mAb</td><td>CST</td><td>60433</td><td></td></tr><tr><td>PENICILLIN STREPTOMYCIN SOL</td><td>Invitrogen</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>pMD2.G</td><td>Addgene</td><td>12259</td><td></td></tr><tr><td>폴리브렌 감염 시약</td><td>Sigma</td><td>TR1003- G</td><td></td></tr><tr><td>폴리에틸렌이민, 분지</td><td>시그마</td><td>408727</td><td></td></tr><tr><td>psPAX2.0</td><td>Addgene</td><td>12260</td><td></td></tr><tr><td>Puromycin</td><td>Invitrogen</td><td>A1113802</td><td></td></tr><tr><td>qPCR Lentivirus Titer Kit</td><td>Abm</td><td>LV900</td><td></td></tr><tr><td>Rock inhibitor Y-27632 dihydrochloride&nbsp;</td><td>Tocris</td><td>1254</td><td></td></tr><tr><td>SB 431542</td><td>Tocris</td><td>1614/10</td><td></td></tr><tr><td>Sox2 항체</td><td>CST</td><td>2748</td><td></td></tr><tr><td>설탕</td><td>시그마</td><td>57-50-1</td><td></td></tr><tr><td>TRYPSIN .05% EDTA&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>25300062</td><td></td></tr><tr><td>U6-459F</td><td>Macrogen</td><td></td><td>GAGGGCCTATT TCCCATGATTC</td></tr><tr><td>마법사 게놈 DNA 정제 키트&nbsp;</td><td>프로메가</td><td>A1120</td><td></td></tr><tr><td>XAV 939</td><td>토크리스</td><td>3748/10</td><td></td></tr></tbody></table>

crispr-cas9 매개 유전자 결실은 feeder-free 조건에서 배양된 인간 만능 줄기 세포에서 발생합니다.

CRISPR-Cas9 Mediated Gene Deletion in Human Pluripotent Stem Cells Cultured Under Feeder-Free Conditions

lentiCRISPRv2 puro에서 L2HGDH sgRNAs 클로닝 lentiCRISPRv2 puro 벡터를 상업적으로 획득하고( 재료 표 참조) BsmB1로 절단한 결과, 1.8Kb 스터퍼 단편이 방출되었습니다. 그림 2A에서 볼 수 있듯이, 벡터의 완전한 분해가 관찰되었습니다. 각 구조체에 대해 벡터 서열 내에서 역 sgRNA 서열을 프라이머로, 전방 프라이머(U6-459F)를 사용하여 삽입체의 유무에 대해 6개의 클론을 스크리닝했습니다. 이 접근법을 사용하면 그림 2B와 같이 삽입체를 가진 클론만 288bp의 PCR 산물을 생성하고, sgRNA의 역염기서열을 포함하지 않는 음성 클론은 PCR 산물을 생성하지 않았습니다.
H9 감염, 안정적인 선택 및 웨스턴 블롯 hESC는 L2HGDH 유전자의 엑손 1을 표적으로 하는 두 가지 다른 sgRNA를 발현하는 렌티바이러스 입자에 감염시키고 퓨로마이신으로 선택했습니다. 안정적으로 동시 발현되는 sgRNA와 Cas9 세포의 이질적인 집단에서 웨스턴 블롯 분석을 수행하여 사용된 두 sgRNA 중 어느 것이 유전자 결실을 유도하는 데 더 효율적인지 확인했습니다. 그림 3A에서 볼 수 있듯이 L2HGDH-sgRNA-1은 이종 세포 집단에서 L2HGDH의 발현을 줄이는 데 다른 염기서열보다 더 효율적이었습니다.
클론 선택, 확장 및 단백질 분석 L2HGDH-sgRNA-1을 발현하는 세포에 대해 단일 세포 선택 및 클론 확장이 이루어졌습니다. 단일 클론을 산출한 웰은 콜로니가 더 확장, 냉동 보존 및 분석할 수 있는 충분한 크기(보통 2주)가 달성될 때까지 표시하고 성장시켰습니다(그림 3B). 웨스턴 블롯 분석을 사용하여 총 22개의 클론을 분석한 결과, L2HGDH에 대해 5개의 동형접합 knockout(23%)이 생성되었습니다. 이 결과는 단일 카세트에서 sgRNA와 Cas9의 안정적인 동시 발현을 위해 렌티바이러스 매개 유전자 전달을 사용하여 유전자 knockout의 높은 효율성을 보여줍니다. 그림 4는 5개의 동형접합 knockout 클론과 대조 세포의 웨스턴 블롯 분석을 보여주며, 선택된 클론의 대조군에 비해 100% 감소된 발현을 보여줍니다.
DNA 수준에서의 분석 Cas9의 PAM 인식 서열의 상류에 있는 CRISPR 돌연변이 부위를 매핑하기 위해 대조 세포와 5개의 서로 다른 클론의 게놈 DNA를 사용하여 돌연변이 부위 기반 특정 프라이머 중합효소 연쇄 반응(MS-BSP PCR)을 수행했습니다. 그림 5에서 볼 수 있듯이 2개의 클론(A5 및 B4)은 PAM 인식 염기서열에 바로 가까운 돌연변이를 가지고 있는 반면, 다른 3개의 클론(A1, A9 및 B12)은 돌연변이가 PAM 부위에 매우 가깝지 않을 수 있으며 L2HGDH 유전자의 엑손 1 내 20bp sgRNA 염기서열의 더 상류에 있음을 보여주었습니다.
DNA에서 정확한 돌연변이를 찾기 위해 대조 세포(벡터만 감염된 H9)의 정제된 PCR 산물과 3개의 서로 다른 CRISPR 클론 A5, A1 및 B4를 Sanger 염기서열 분석을 실시하고 PAM site8의 상류에 있는 다중 정렬 도구 clustalw를 사용하여 돌연변이 부위를 매핑했습니다. 그 결과 PAM 부위의 상류에 있는 A5 클론에서 결실 돌연변이가 밝혀졌습니다. 다른 두 클론인 A1 및 B4는 그림 6에서 강조된 바와 같이 PAM 부위의 상류에 삽입 돌연변이를 보여주었습니다.
클론의 기능 분석 hESC에서 CRISPR knockout 세포주를 생성하면 다음 단계는 다능성과 분화 가능성을 확인하는 것입니다. 이를 위해 A1, A5 및 B4의 세 가지 다른 클론에 대해 서로 다른 다능성 마커를 테스트하고 결과를 대조군(벡터만 감염된 H9) 세포와 비교했습니다. 그 결과, OCT4, NANOG 및 SOX2 마커에 대한 면역염색에 의해 결정된 knockout 세포주의 다능성 전위에는 변화가 없는 것으로 나타났습니다. 다음으로, 세포 증식 마커인 KI67에 대해 대조군 및 knockout 세포주도 염색했는데, 이 역시 대조군에 비해 knockout 세포주에서 변화가 없는 것으로 나타났습니다. 이러한 결과는 CRISPR knockout이 이러한 세포의 자가 재생 특성에 영향을 미치지 않는다는 것을 보여줍니다. 또한, EB와 콜로니 형성도 영향을 받지 않았습니다(그림 7). 우리 실험실에서 확립된 in vitro 방법을 사용하여 PAX6(neuroectoderm marker), Brachyury(mesoderm marker) 및 FOXA2(endoderm marker)에 대한 면역염색을 통해 확인된 바와 같이 모든 클론을 3개의 생식층 세포로 성공적으로 분화시켰습니다. 대조군 세포주에 비해 knockout 세포주의 분화 잠재력에는 변화가 관찰되지 않았으며, 이는 knockout 세포가 분화 잠재력을 유지한다는 것을 보여주었습니다(그림 8).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67296/67296fig01.jpg"> 
그림 1: 5단계로 연구 설계를 보여주는 개략도. 1단계: Bsmb1 분해된 V2 CRISPR 벡터로 sgRNA를 설계하고 클로닝합니다. 2단계: 폴리펙션을 사용하여 HEK293T 세포를 동시 transfection하고 초원심분리를 사용하여 바이러스 농도를 측정함으로써 패키징 플라스미드와 함께 sgRNA를 운반하는 진입 벡터를 사용하여 렌티바이러스 입자를 생성합니다. 3단계: MOI 10-20에서 렌티바이러스 입자를 사용한 hESC 감염 및 퓨로마이신을 사용한 안정적인 세포 선택 후 sgRNA의 효율성을 확인하기 위한 이종 세포 집단 분석. 4단계: 이질적인 집단에서 최대 knockdown을 보인 세포에서 희석 방법을 제한하여 단일 세포 클로닝 및 단일 클론 선택. 5단계: 단일 클론의 확장 및 DNA 수준, 단백질 분석, 줄기 및 분화 가능성에 대한 클론의 기능 분석. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67296/67296fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67296/67296fig02.jpg"> 
그림 2: lentiCRISPR V2.puro 벡터에서 sgRNA의 클로닝. (A) 제한 효소 BsmB1을 사용한 lentiCRISPR V2.puro 벡터의 분해. 화살표는 벡터의 분해 시 방출되는 1.8Kb 스터퍼 단편을 나타냅니다. (B) L2HGDH sgRNA 구조체 1 및 2의 다양한 클론에 대한 콜로니 PCR 분석. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67296/67296fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67296/67296fig03.jpg"> 
그림 3: single-cell selection을 사용한 Western blot 및 클론 증식. (A) 안정적으로 동시 발현되는 sgRNA(L2H-1 및 L2H-2) 및 Cas9의 이종 집단과 대조군 (C) H9 hESC의 두 가지 다른 생물학적 복제(S1 및 S2)에서 웨스턴 블롯 분석. (B) L2HGDH-sgRNA-1을 안정적으로 발현하는 H9 세포의 단일 세포 선택 및 클론 확장. 화살표는 단일 클론만 보여주는 96개의 웰 플레이트의 웰을 나타냅니다. 스케일 바 = 100 μM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67296/67296fig03large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67296/67296fig04.jpg"> 
그림 4: H9의 다양한 클론에서 추출한 웨스턴 블롯 분석. (A-C) 22개 클론의 총 세포 용해물에서 웨스턴 블롯 분석은 L2HGDH에 대해 5개의 동형접합 knockout(23%)을 산출했습니다. (D) 웨스턴 블롯을 사용한 다른 생물학적 복제 실험에서 L2HGDH knockouts 확인. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67296/67296fig04large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67296/67296fig05.jpg"> 
그림 5: 다양한 H9 클론의 MSBSP PCR 분석. (A) MSBSP PCR 분석에 사용되는 L2HGDH 엑손 1의 염기서열 분석. (B) 대조군 및 H9 V2 L2HGDH KO Clone B4를 사용한 MSBSP PCR 분석을 위한 어닐링 온도 최적화. 96.8에서 컨트롤은 밴드를 표시하지만 B4는 화살표로 표시된 것처럼 밴드를 표시하지 않습니다. (C) 모든 동형접합 KO 클론을 분석한 결과, 엑손 1 내 돌연변이 부위의 매핑이 아래와 같았습니다. A1 = In/Del이 PAM 사이트에 가깝지 않음; A5 = PAM 사이트에 가까운 In/Del; A9 = PAM 사이트에 상당히 가까운 In/Del; B4 = In/Del PAM 사이트에 매우 가까움 B12 = In/Del PAM 사이트에 가깝지 않음. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67296/67296fig05large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67296/67296fig06.jpg"> 
그림 6: Sanger 염기서열 PCR 산물과 참조 L2HGDH 엑손 1 염기서열의 정렬. A1, A5 및 B4의 Sanger 염기서열 PCR 산물과 대조 세포의 다중 정렬은 NCBI 데이터베이스의 L2HGDH 의 첫 번째 엑손 내에서 참조 염기서열과 함께 수행되었습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67296/67296fig06large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67296/67296fig07.jpg"> 
그림 7: CRISPR knockout 세포주의 기능적 특성 분석. (A) 세포는 대조군에 감염된 H9 hESC에 대한 다능성 마커(OCT4, NANOG, SOX2), 자가 재생(KI67), EB 및 콜로니 형성에 대해 면역염색되었습니다. 스케일 바: 100 μM. (B) 양(+ve) 발현 세포의 비율은 DAPI 염색을 기준으로 계산되었습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67296/67296fig07large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67296/67296fig08.jpg"> 
그림 8: CRISPR knockout 세포주의 분화 가능성. 대조군에 감염된 H9 세포와 관련하여 PAX6(신경외배엽), Brachyury(중배엽) 및 FOXA2(내배엽)에 대한 마커를 사용하여 분화 가능성 측면에서 CRISPR knockout 세포주의 기능적 특성 분석. 스케일 바: 100 μM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67296/67296fig08large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>프로토콜 단계</td>
			<td>소요 시간</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LentiCRISPRv2에서 sgRNA 클로닝</td>
			<td>4 일</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>렌티바이러스 생산 및 역가 측정</td>
			<td>5 일</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hESC 감염, 안정적인 세포 선택 및 증식</td>
			<td>2 주</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>단일 세포 클론 선택 및 확장</td>
			<td>2 주</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>클론의 기능 분석</td>
			<td>2 주</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
표 1: 프로토콜 단계 및 필요한 예상 시간에 대한 타임라인.

CRISPR-Cas9 매개 유전자 결실은 feeder-free 조건에서 배양된 인간 만능 줄기 세포에서 발생합니다.

The CRISPR-Cas9 system for genome editing has revolutionized gene function studies in mammalian cells, including stem cells. However, the practical ...

crispr-cas9-mediated-gene-deletion-human-pluripotent-stem-cells

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

우리는 렌티바이러스 기반의 재프로그래밍 및 특성화된 무인자 인간 유도 만능 줄기세포를 유도하고 추정되는 임상 등급 조건으로 전환하기 위한 프로토콜을 설명합니다.

의 유도 및 특성 형질 전환 유전자가없는 인간 유도 다 능성 정의 임상 수준의 조건으로 세포주 및 변환 줄기

인핸서 활성의 실험적 검증은 기능 손실 분석으로 접근하는 것이 가장 좋습니다. 여기에 제시된 효율적인 프로토콜은 CRISPR/Cas9 매개 결실을 사용하여 하이브리드 게놈(Mus musculus129 x Mus castaneus)을 포함하는 F1 ES 세포에서 유전자 전사의 대립유전자 특이적 조절을 연구합니다.

생성 CRISPR은 / Cas9 중재 Monoallelic 삭제할 경우는 마우스 배아 줄기 세포의 증강 기능을 연구하는

인간 만능 줄기 세포(hPSC)의 게놈 편집을 빠르고 효율적으로 수행할 수 있습니다. 여기에 제시된 것은 EGFP를 발현하고 항생제 내성을 도입하기 위해 AAVS1 세이프 하버 유전자 자리를 편집하여 예시된 바와 같이 hPSC를 유전적으로 조작하는 강력한 실험 절차입니다.

게놈 편집 인간 다 능성 줄기 세포의 설립 : 분리에 타겟팅에서

프로토콜은 iCRISPR 플랫폼을 사용 hPSC 돌연변이 라인을 생성하고 설명하는 글루코스 응답 형 β 세포로 hPSCs 차별화. hPSC 지시 분화와 게놈 편집 기술을 결합하면 인간 발달 및 질병 진행의 계보 결정의 역할의 체계적인 분석을위한 강력한 플랫폼을 제공합니다.

인간의 췌장 개발에 리니지의 결정 요인을 들여다보기위한 게놈 편집 및 hPSCs의 감독 차별화

이 CRISPR/Cas9 ribonucleoproteins 및 수정된 된 특성을 사용 하 여 편집 다음 프로토콜 자세히 설명 발자국 없는 유도 만능 줄기 세포 (Ipsc)의 세대 급지대 무료 조건에서 인간의 췌장암 세포에서 단일 셀 복제합니다.

효율적인 생성 및 급지대 무료 Ipsc CRISPR Cas9 시스템을 사용 하 여 인간의 췌 장 세포에서의 편집

프로토콜에 대 한 빠른 마우스에서 유전자 장애 CRISPR/Cas9-중재 하 고 인간의 기본 조 혈 모 세포가이 문서에서 설명 하는. Cas9-sgRNA ribonucleoproteins sgRNAs 녹음 방송 생체 외에서 그리고 상업적인 Cas9를 통해 생성 된 electroporation 통해 소개 된다. 높은 편집 효율성 제한 시간 및 금융 비용으로 달성 된다.

CRISPR/Cas9에 의해 Murine 인간과 조 혈 조상 세포의 고효율 유전자 장애

여기에 설명 된 endogenously 태그 프로토콜 표시 CRISPR/Cas9를 사용 하 여 인간 유도 만능 줄기 세포에 형광 태그와 단백질 이다. 상 편집된 셀 형광 활성화 된 세포 분류에 의해 풍성 하 게 하 고 클론 세포 생성 됩니다.

인간에서 태그 생 단백질 유도 만능 줄기 세포를 사용 하 여 CRISPR/Cas9

이 프로토콜은 인간 다능성 줄기 세포에서 CRISPR-CAS9를 사용하여 정의된 이형 이형 또는 동형접합 뉴클레오티드 변화의 생성을 용이하게 하는 방법을 제공한다.

인간 다능성 줄기 세포에서 CRISPR-CAS9를 사용하여 정의된 게놈 수정 생성

여기에서는 piggyBac계 공여 플라스미드와 Cas9 nickase 돌연변이체를 이용한 인간 만능줄기세포에서 원활한 유전자 편집을 위한 상세한 방법을 설명한다. 인간 배아 줄기 세포 (hESCs)에서 간세포 핵 인자 4 알파 (HNF4α) 유전자좌의 엑손 8에 2 점 돌연변이가 도입되었다.

원활한 게놈 편집을 사용하여 인간 만능 줄기 세포에 점 돌연변이 도입

다음 프로토콜은 녹아웃 완료 세럼 교체 피더 - 프리 미디어 (KSR - FF)를 사용하여 피더 무료 문화 인간 유도 Pluripotent 줄기 (IPS) 셀을 적응을위한 지침을 제공합니다. 일단 지속적인 유지 보수를위한 지침도 제공되며, 적응.

완료 녹아웃 세럼 교체 피더 - 무료 매체를 사용하여 인간의 IPS 세포 피더 - 자유 적응력, 문화와 Passaging

배우세요 CRISPR-Cas9을 이용한 L2HGDH 유전자 결실 방법을 인간 배아 줄기세포(H9)에서 적용하는 기술입니다. 이 연구는 다능성과 분화 능력을 유지하면서 안정적인 유전자 편집을 가능하게 합니다.

CRISPR-Cas9 매개 유전자 결실은 feeder-free 조건에서 배양된 인간 만능 줄기 세포에서 발생합니다.

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