Name: 각막 봉합사와 결합된 각막 상피 소파술을 기반으로 한 쥐에서 중증 각막 염증 모델 확립 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-11-22T14:20:00.000+00:00
Duration: 4 min 48 s
Description: 학습하세요 쥐에서 각막 상피 소파술과 봉합사를 결합한 중증 각막 염증 모델 수립 방법을. 이 기법은 각막 재생에 필수적인 림발 줄기세포 손상 없이 염증을 유도하여 안과 질환 치료 연구에 활용됩니다.

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</ol>

<table><tbody><tr><td>10-0 봉합 라인</td><td>Alcon, Inc., 미국</td><td>8065698001</td><td></td></tr><tr><td>2mm 각막 트레핀</td><td>쑤저우 XVI Vision Company, 중국</td><td>http://www.66vision.com/</td><td></td></tr> <tr><td>20 &mu; L, 100 &뮤; L, 1mL 피펫 건 헤드, 세포 배양 플레이트 배양 플레이트, 원심 분리기 튜브</td><td>Guangzhou Jiete Biological Co., Ltd., 중국</td><td>https://www.jetbiofil.com/index.html-20</td>/-80 &deg<td></td></tr><tr><td>; C 냉장고</td><td>Qingdao Haier Company, 중국</td><td>https://www.haier.com/cn/</td><td></td></tr> <tr><td>A 10mL 주사기</td><td>&nbsp; Zhejiang Condelai Medical Device Co., Ltd., 중국</td><td>https://en.kdlchina.com/zhejiang/25.html</td><td></td></tr><tr><td>슬라이드</td><td>ShiTai Company</td><td>188105</td><td></td></tr><tr><td>Amylene alcohol</td> Shanghai를 준수합니다<td>. Macklin Biochemical, 중국</td><td>http://www.macklin.cn/products/</td><td></td></tr> <tr><td>Anti-Cytokertin</td><td>Abcam, 영국</td><td>ab76318</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Keratin 12 항체 EPR17882</td><td>Abcam, 영국</td><td>ab185627</td><td></td></tr><tr><td>Anti-PAX6 항체</td><td>Abcam, 영국</td><td>ab195045</td><td></td></tr><tr><td>안티 스트리핑 슬라이드, 커버 슬립</td><td>Jiangsu Shitai Experimental Equipment Co., Ltd. , 중국</td><td>https://cn.citotest.com/</td><td></td></tr> <tr><td>Autoclave</td><td>Hirayama, 일본</td><td>https://hirayama.com.cn/about/</td><td></td></tr> <tr><td>Avertin</td><td>Shanghai Aladdin Biochemical Technology, 중국</td><td>https://www.aladdin-e.com/zh_cn/A111225.html</td><td></td></tr><tr><td>클로로포름</td><td>Shanghai Biological Engineering Co., Ltd., 중국</td><td>https://www.siobp.com/web</td><td></td></tr><tr><td>CO2 오븐 인큐베이터, 초음파 크러셔, 원심분리기</td><td>Thermo Fisher Technologies Inc., 미국</td><td>https://www.thermofisher.cn/cn/zh/home.html</td><td></td></tr><tr><td>컨포칼 현미경</td><td>Shanghai Qinxiang Scientific Instrument Co., Ltd., 중국</td><td>https://www.clinx.cn/about</td><td></td></tr><tr><td>각막 상피 겸자</td><td>Suzhou XVI Vision Company, 중국</td><td>53418D</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Vector. Inc., 미국</td><td>H-1000</td><td></td></tr><tr><td>DEPC 물</td><td>&nbsp; Shanghai Biological Engineering Co., Ltd., 중국</td><td>https://www.siobp.com/web</td><td></td></tr><tr><td>Dicuro 아이크림(ofloxacin 아이크림)</td><td>Santian Pharmaceutical Corporation, 일본</td><td>https://www.santen.com/asia</td><td></td></tr><tr><td>D-KSFM, 배양 배지, 이중 항체 및 PBS</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc., 미국</td><td>https://www.thermofisher.cn/cn/zh/home.html</td><td></td></tr><tr><td>ED1</td><td>AbD Serote c, 영국</td><td>&nbsp; </td><td></td>MCA341GA</tr><tr><td>전자 저울</td><td>Shanghai Ohaus Biotechnology Company, 중국</td><td>http://shbio.com/company</td><td></td></tr><tr><td>멤브레인 인클로저</td><td>Parafilm, Inc., 미국</td><td>https://www.sigmaaldrich.cn</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescein 나트륨 테스트 스트립은 안과에서 사용되었습니다</td><td>Tianjin Jingming New Technology Development Co., Ltd., 중국</td><td>https://www.eworldtrade.com/c/jingmingtechnological/</td><td></td></tr><tr><td>형광 반전 위상차 현미경 시스템</td><td>TE-2000U, 니콘, 일본</td><td>https://www.microscopyu.com/museum/eclipse-te2000-inverted-microscope</td><td></td></tr><tr><td>냉동 탁상용 원심분리기</td><td>에펜도르프, 독일</td><td>https://www.eppendorf.sh.cn&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>유리 시트 프레임</td><td>Xiamen Tianjing Biotechnology Co., Ltd., 중국</td><td>http://www.tagene.net/</td><td></td></tr> <tr><td>H-1200 DAPI 밀봉제</td><td>포함 Xiamen Juin Biotechnology Co., Ltd., 중국</td><td>https://www.bosonbio.com.cn/</td><td></td></tr> <tr><td>HE 염색 키트</td><td>Auragene, 중국</td><td>http://jushengwu.com/a048/</td><td></td></tr> <tr><td>Hematoxylin-eosin 염료 솔루션 키트</td><td>AURAGEN, 미국</td><td>P032IH</td><td></td></tr><tr><td>고정밀도 및 저정밀도 전자 저울</td><td>Sdolis, 독일</td><td>https://www.solisinverters.com/global</td><td></td></tr><tr><td>이소프로판올</td><td>Shanghai Sinopharm Chemical Reagents Co., Ltd., 중국</td><td>https://en.reagent.com.cn/</td><td></td></tr> <tr><td>Ki-67 항체</td><td>Abcam, 영국</td><td>ab16667</td><td></td></tr><tr><td>액체 질소</td><td>Xiamen Yidong Gas Co., Ltd., 중국</td><td>https://www.china.tdk.com.cn/tdk_chn_en/tdk_xiamen/</td><td></td></tr> <tr><td>Microhand 홀더</td><td>Suzhou XVI Vision Company, 중국</td><td>http://www.66vision.com/</td><td></td></tr> <tr><td>멀티포름알데히드 분말</td><td>Sigm, 미국</td><td>https://www.sigmaaldrich.cn</td><td></td></tr><tr><td>상온 원심분리기 46</td><td>Eppendorf, 독일</td><td>https://www.thermofisher.cn</td><td></td></tr><tr><td>10월</td><td>Shanghai Maokang Biotechnology Co., Ltd., China</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Ordinary biological micrographic system</td><td>Eclipse 50i, Nikon, Japan</td><td>https://www.microscope.healthcare.nikon.com/zh_CN/products/upright-microscopes/eclipse-ni-series</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Shanghai Anjin Biotechnology Co., Ltd, 중국</td><td>SH30256.01</td><td></td></tr><tr><td>PCR 및 반응기 장치</td><td>Biometra Thermocycler, Germany</td><td>https://www.analytik-jena.com/products/life-science/pcr-qpcr-thermal-cycler/thermal-cycler-pcr/biometra-tone-series/</td><td></td></tr> 다양한 <tr><td>사양의 피펫</td><td>Eppendorf Company, Germany</td><td>https://www.eppendorf.com/cn-zh/</td><td></td></tr> <tr><td>Primers for Rt-PCR</td><td>Shanghai Bio-Tech Co., Ltd.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>프로메인 하이드로클로라이드 0.5% 안약</td><td>Alcon, Inc., 미국</td><td>https://www.alcon.com/about-us</td><td></td></tr><tr><td>쥐 PMN 항체</td><td>Fitzgerald, 미국</td><td>20R-PR020</td><td></td></tr><tr><td>실시간 형광 정량 PCR</td><td>Applied Biosystems,&nbsp; 미국</td><td>https://www.thermofisher.cn</td><td></td></tr><tr><td>역 전사 키트</td><td>TAKARA, 일본</td><td>https://www.takarabiomed.com.cn/</td><td></td></tr> <tr><td>Slit lamp</td><td>TOPCON, 일본</td><td>https://topconchina.cn/</td><td></td></tr> <tr><td>부드러운 집게</td><td>Suzhou XVI Vision Company, 중국</td><td>http://www.66vision.com/</td><td></td></tr> <tr><td>Specimen-box</td><td>Lambolid (Fuzhou) Biotechnology Co., Ltd., 중국</td><td>http://chuangdianbio.com/</td><td></td></tr> <tr><td>Superclean bench</td><td>New Plus Pi Art High Technology Company Limited, 싱가포르</td><td>https://www.hi-p.com/</td><td></td></tr> <tr><td>톱니집게</td><td>집게 Suzhou XVI Vision Company, 중국</td><td>http://www.66vision.com/</td><td></td></tr> <tr><td>Toppicamide 점안액(Medol)</td><td>Alcon, Inc., 미국</td><td>https://www.alcon.com/about-us</td><td></td></tr><tr><td>미량 핵산 단백질 농도 검사</td>자 <td>Thermo Fisher Technologies Inc., 미국</td><td>https://www.thermofisher.cn/cn/zh/home.html</td><td></td></tr><tr><td>Trizol</td><td>Invitrogen 미국</td><td>https://www.fishersci.com/us/en/brands/IIAM0WMR/invitrogen.html</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss, 수술용 현미경</td><td>Carl ZEIS, 독일</td><td>https://www.zeiss.com/corporate/en/about-zeiss.html</td><td></td></tr></tbody></table>

각막 봉합사와 결합된 각막 상피 소파술을 기반으로 한 쥐에서 중증 각막 염증 모델 확립

Establishing a Severe Corneal Inflammation Model in Rats Based on Corneal Epithelium Curettage Combined with Corneal Sutures

그림 1A에서 볼 수 있듯이, 세극등을 이용한 관찰을 통해 각막 상피의 치유가 손상되었음을 발견했다. 정상적인 상황에서는 중앙 각막 상피가 제거 후 24-48시간 이내에 완전히 치유되지만, 봉합사 모델과 결합된 각막 중앙 상피 절제술에서는 새로운 혈관이 계속 존재했습니다. 모델이 확립된 지 3일째 되는 날, 유의미한 각막 윤부 부종과 신생혈관화가 관찰되었으며, 각막 윤부 줄기 세포 결핍의 전형적인 징후가 국소적으로 나타났습니다. 시간이 지나 7일째 되는 날이 되어도 치유는 여전히 완료되지 않았습니다. 각막 염증 지수는 섬모 울혈, 부중심성 각막 부종 및 중심 각막 부종을 사용하여 평가되었습니다. 각막 부종은 점차 악화되었고, 각막 염증(그림 1A)은 계속 악화되었습니다. 또한 각막 혈관신생술은 염증의 지표입니다. 염증이 진행됨에 따라 각막 신생혈관형성(그림 1B)과 염증 지수(그림 1C)가 지속적으로 증가했다.
모델 제작 후 7일 후에 눈 조직에 cryoembedding을 수행했습니다. 헤마톡실린(Hematoxylin)과 에오신 염색(그림 2A)은 쇄연부와 중앙 각막에서 상피가 두꺼워지는 것을 보여주었으며, 상피 배열이 정상적인 형태를 잃고 비정형 증식을 나타냅니다. 각막 기질은 염증 세포의 상당한 침투와 함께 부종으로 보였다. PMN 및 ED1 면역형광 염색(그림 2B)을 사용하여 호중구와 대식세포의 침투가 현저히 증가하는 것이 관찰되었습니다. 이 연구는 IL-1β(그림 2C) 및 MIP-1α(그림 2D)를 사용하여 염증 인자를 평가한 결과, IL-1β는 3일째에 최고조에 달한 후 점차 감소하는 반면 MIP-1α는 시간이 지남에 따라 지속적으로 증가하는 것으로 나타났습니다.
만성 염증은 일반적으로 Pax6 하향 조절, Krt12 발현 감소, 각막 상피의 편평 화생과 같은 일련의 윤부 줄기 세포 결핍을 유발합니다. 본 연구에서 개발된 모델이 각막 상피 표현형에서 이러한 변화를 유도할 수 있는지 확인하기 위해 각막 상피의 Krt12(그림 3A) 및 Pax6(그림 3B)에 대한 면역형광 염색을 수행했습니다. Krt12 발현은 염증이 지속됨에 따라 감소했으며, 7일째에는 단일 Krt12 양성 세포만 관찰되었으며, 각막 상피에서 Pax6 발현이 현저히 감소했습니다. mRNA 수준에서, 정상 각막 상피 마커 Krt12(그림 3C) 및 Pax6(그림 3D)의 발현 수준은 7일째에 현저히 감소했습니다. 그러나, 편평 화생 마커 Krt10(그림 3E) 및 Sprr1b(그림 3F)의 발현 수준은 7일째에 유의하게 증가하였다.
증식 마커 Ki67을 사용하여 각막 상피를 염색한 결과, 7일째까지 Ki67 양성 각막 상피 세포의 수가 현저히 감소한 것으로 나타났습니다(그림 4A). 각막 상피 줄기 세포의 상태는 각막 윤부 줄기 세포 특이적 마커 ABCG2(그림 4B) 및 상피 전구 세포 마커 P63(그림 4C)을 사용하여 평가되었습니다. ABCG2 및 P63 수치는 정상 그룹보다 현저히 낮았습니다. 또한, 줄기세포에 대한 황금 표준인 클론 배양 방법을 사용하여 이 과정에서 각막 윤부 줄기 세포의 변화를 평가했습니다. 우리는 각막 윤부 줄기세포의 클론 형성 속도(그림 4D)가 3일째에 감소하고 7일째에 크게 감소하는 것을 관찰했으며, 클론의 평균 면적이 작아지고 7일째에는 소수의 홀로클론만 볼 수 있습니다. 콜로니 형성 효율(colony-forming efficiency, CFE)은 배양 접시의 현미경 영역에서 볼 수 있는 세포 클론을 계수하여 얻어졌습니다. CFE(그림 4E)는 염증성 상태에서 각막 윤부 줄기세포의 수가 점진적으로 감소함을 나타냅니다. 이는 이 모델의 심각한 염증이 각막 윤부 상피 줄기세포의 고갈로 이어지며, 이 과정은 각막 윤부 줄기세포의 표현형 변형을 유도하지 않고 오히려 분화 또는 자가 재생에 문제를 일으킨다는 것을 시사합니다.
본 연구에서 사용된 염증 모델은 염증성 세포의 각막으로의 광범위한 침투, 각막 상피의 이형성증, 정상 각막 상피 표현형에서 Pax6 및 Krt12의 발현 방해 또는 감소를 포함하여 LSCD의 특징적인 각막 변화를 초래했습니다. 또한 Krt10 mRNA 발현이 유의하게 증가했습니다. 요약하면, 이 실험 모델은 염증에 의해 유발된 각막 상피 줄기세포의 비정상적인 분화를 연구하는 데 매우 적합합니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67305/67305fig1v2.jpg"> 
그림 1: 염증 모델의 확립. 심각한 염증이 각막 상피 줄기세포에 미치는 영향을 연구하기 위해 중증 염증 모델을 확립했습니다. (A) 모델을 유도한 후, 슬릿램프 사진을 사용하여 각막을 관찰했습니다. 모델링 3일 후, 쥐의 각막 변부는 심각한 부종을 보였으며, 명백한 신생혈관화와 국소 증식이 나타났으며, 이는 각막 윤부 줄기세포 결핍의 전형적인 징후입니다. 7일째가 되자 각막 부종이 점차 악화되었고 신생혈관형성은 계속 커졌습니다. 염증이 진행됨에 따라 (B) 각막 신생혈관 형성과 (C) 염증 지수가 지속적으로 증가했다. *P &lt; 0.05, *P &lt; 0.0001. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67305/67305fig1v2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67305/67305fig02.jpg"> 
그림 2: 모델링 후 염증 반응. 각막에서 모델에 의해 유도된 염증 반응을 평가했습니다. (A) 안구의 헤마톡실린(Hematoxylin)과 에오신 염색 결과, 염증 과정에서 윤부와 중심 각막 상피가 모두 두꺼워지고, 각막 상피 배열이 정상적인 형태를 잃고 비정형 증식의 징후를 보이는 것으로 나타났습니다. (B) 대식세포 마커 ED1(녹색) 및 호중구 마커 PMN(빨간색)이 유의하게 증가하였다. RT-qPCR은 각막 상피 염증 인자 (C) IL-1β 및 (D) MIP-1α의 유의한 상승을 보여주었습니다. 파란색은 DAPI, 스케일 바 = 50 μm로 핵 염색을 나타냅니다. 피 &lt; 0.001. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67305/67305fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67305/67305fig03v2.jpg"> 
그림 3: 염증성 질환 하에서 세포의 표현형 변화. 윤부 상피에서 (A, 빨간색) KRT12 및 (B) PAX6에 대한 면역 염색. (C) KRT12 mRNA 발현 수준은 염증이 진행됨에 따라 현저한 감소를 보입니다. (D) PAX6 mRNA 발현은 염증성 조건에서 윤부 상피의 비정상적인 분포와 현저한 감소를 나타냅니다. 반대로, (E) Krt10과 비정상적으로 분화된 각막 상피 마커 (F) Sprr1b의 mRNA 발현은 염증 중에 크게 증가합니다. 파란색은 DAPI, 스케일 바 = 50 μm로 핵 염색을 나타냅니다. **p &lt; 0.01, ***p &lt; 0.001, ****p &lt; 0.0001. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67305/67305fig03large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67305/67305fig04.jpg"> 
그림 4: 염증 상태에서 윤부 줄기세포의 변화. (A, 빨간색) Ki67의 면역형광 이미지는 염증 유도 후 증식 세포의 변화를 보여줍니다. 줄기세포 마커 (B) ABCG2의 mRNA 발현이 현저히 감소합니다. 전구 세포 마커 (C) p63도 발현됩니다. (D) 크리스탈바이올렛 염색 이미지 및 (E) CFE는 염증성 조건에서 윤부 줄기세포의 수가 감소함을 보여줍니다. 파란색은 DAPI로 염색된 핵을 나타냅니다. 눈금 막대는 50 μm입니다. *P &lt; 0.05, **P &lt; 0.01, ***P &lt; 0.001, ****P &lt; 0.0001. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67305/67305fig04large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="2">프라이머 이름</td>
			<td colspan="3">프라이머 서열</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">티엔에프-a</td>
			<td>전달</td>
			<td colspan="3">5 ' - TCAGTTCCATGGCCCAGAC - 3 '</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>후진</td>
			<td colspan="3">5'-GTTGTCTTTGAGATCCATGCCATT-3'</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">IL-1β</td>
			<td>전달</td>
			<td colspan="3">5'-CCTCGTCCTAAGTCACTCGC-3'</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>후진</td>
			<td colspan="3">5'-GGCTGGTTCCACTAGGCTTT-3'</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">팍스6</td>
			<td>전달</td>
			<td colspan="3">5'-GTGTTCAGTGCAGAGCCTTC-3'</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>후진</td>
			<td colspan="3">5'-TTCACCGTTGCTGTTCACTG-3'</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">크르트12</td>
			<td>전달</td>
			<td colspan="3">5'-AGCTAACGCGGAACTGGAAA-3'</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>후진</td>
			<td colspan="3">5'-CTCTCCGCTCTTGGTGAGGT-3'</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">Krt10</td>
			<td>전달</td>
			<td colspan="3">5'-TCCGGGATCTGGAAGAGTCAA-3'</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>후진</td>
			<td colspan="3">5'-TTGGGTAAGCTTTGCTAAGTGGAA-3'</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">스프르1b</td>
			<td>전달</td>
			<td colspan="3">5'-CCATCCCAAGGCACCTGAG-3'</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>후진</td>
			<td colspan="3">5'-TGCTGGTATGGTGATGGAGT-3'</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">말라</td>
			<td>전달</td>
			<td colspan="3">5'-CACCCGCGAGTACAACCTTC-3'</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>후진</td>
			<td colspan="3">5'-CCCATACCCACCATCACACC-3'</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
표 1: 정량적 RT-PCR에 사용된 프라이머의 염기서열.

Corneal inflammation, especially severe corneal inflammation, plays a significant role in the development of corneal limbal stem cell dysfunction. ...

establishing-severe-corneal-inflammation-model-rats-based-on-corneal

Research

연구

JoVE Journal

Medicine

의학

이 비디오는 돼지의 눈에서 절개한 각막 단추를 사용하여 세균성 각막염에 대한 체외 모델을 설정하는 프로토콜에 대해 설명합니다. 접종된 박테리아는 각막 상피 절개 부위를 통과하여 기저 기질에 침입하고 각막 조직 내에서 생체 내 감염을 모방하는 감염을 일으킵니다.

세균성 각막염의 Porcine Ex vivo 각막 모델: 각막 상피 세포에서 세균 감염을 확립하는 기술

소 각막 내피 세포의 일차 배양 각막 내피 간엽 전이의 메커니즘을 조사 하였다. 또한, 래트 각막 내피 cryoinjury 모델 생체 내 각막 내피 간엽 전환을 증명 하였다.

생체 외 및 생체 내 모델에서 각막 내피 세포 - 중간 엽 전이를 공부하기

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여기서는 각막을 자극하는 감각 섬유를 손상시키는 세 가지 방법을 제안합니다. 이러한 방법은 생쥐의 축삭 재생에 대한 연구를 용이하게 합니다. 다른 동물 모델에 적용할 수 있는 이 세 가지 방법은 각막 신경 분포 생리학 및 재생 연구에 이상적입니다.

쥐 각막의 신경 영양성 각막염 및 신경 재생을 유도하는 세 가지 전략

토끼의 각막 기질 상처 수리를 위한 현장 블루라이트-가교 젤라틴-리보플라빈 하이드로겔의 제조, 농축 및 적용을 위한 재현 가능한 프로토콜이 제시되었으며, 수술 처리, 부분 족근경 및 수술 후 관리를 위한 절차적 단계를 포함합니다.

토끼의 각막 상처 수리를 위한 강화 광가교 젤라틴-리보플라빈 하이드로겔의 제작 및 외과적 적용

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각막 봉합사와 결합된 각막 상피 소파술을 기반으로 한 쥐에서 중증 각막 염증 모델 확립

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