Assembly and Quantification of Co-Cultures Combining Heterotrophic Yeast with Phototrophic Sugar-Secreting Cyanobacteria(종속영양 효모와 광영양성 설탕 분비 시아노박테리아를 결합한 공동 배양의 조립 및 정량화)

본 연구는 자당을 분비하는 시아노박테리아(cyanobacteria)와 종속영양균(heterotrophic fungi)을 포함하는 합성 컨소시엄의 미생물 네트워킹을 이해하는 것을 목표로 합니다. 과거에는 미생물학자들이 보통 단일 미생물의 순수 배양을 연구했습니다. 그러나 자연에서 미생물은 일반적으로 컨소시엄에서 발생하므로 혼합 배양에서의 미생물 네트워킹을 이해하는 것도 필수적입니다.

한 가지 주요 과제는 모든 컨소시엄 구성원의 성장을 허용하는 매체를 포함하여 적절한 성장 조건을 찾는 것입니다. 여기서 우리는 주로 종속영양 부재의 성장에 기초를 제공하는 광영양 부재에 의한 가장 높은 자당 생성 및 분비를 최적화하는 데 중점을 둡니다. 액세닉 배양(axenic culture)의 성장을 추적하기 위해 광학 밀도 또는 후방 산란 측정과 같은 일반적인 기술을 사용할 수 있습니다.

그러나 이러한 기술은 개별 종의 세포 수가 필요한 공동 배양에는 적용되지 않습니다. 당사의 프로토콜에서는 형광 표지와 세포 계수의 조합을 적용하여 서로 다른 공동 배양 파트너를 구별합니다. 또한 간단하고 저렴한 비용에서 비용이 많이 들고 처리량이 많은 방법에 이르기까지 다양한 방법으로 유사한 결과를 얻을 수 있음을 보여줄 수 있습니다.

시작하려면 3일 동안 배양액을 성장시킨 후 시아노박테리아 세포를 펠렛화합니다. 펠릿을 25ml의 멸균 CoYBG-11 배지에 재현탁합니다. 4, 실온에서 20분 동안 000g에서 샘플을 원심분리하십시오.

그런 다음 디캔팅으로 상등액을 버립니다. 광학 밀도가 결정되면 멸균 조건에서 250ml 배플 플라스크에 계산된 양의 CoYBG-11을 추가합니다. 그 후, 계산된 시아노박테리아 및 종속영양 세포 현탁액을 추가하여 50ml의 최종 배양 부피를 얻습니다.

50ml 배양을 위해 1몰 IPTG 스톡에서 50마이크로리터를 사용합니다. 그런 다음 플라스크를 초당 평방 미터당 약 200마이크로몰 광자로 광자세척기에 넣습니다. 섭씨 30도에서 2%의 이산화탄소, 150RPM에서 궤도 흔들림, 75%의 습도로 환경을 보충합니다.

샘플링을 위해 인큐베이터에서 플라스크를 꺼내 멸균 조건에서 배양액에서 1ml 샘플을 채취합니다. 현미경 정량화를 준비하려면 계수 챔버와 커버 유리에 먼지와 세포가 없는지 확인하십시오. 파손을 피하면서 약간의 압력으로 두 개의 지지대에 커버 유리를 밀어 넣어 올바르게 배치하십시오.

커버 유리가 제대로 배치되면 커버 유리가 미끄러지지 않는지 확인하면서 두 유리 표면 사이에 있는 뉴턴의 고리를 관찰합니다. 이제 세포 현탁액을 철저히 혼합하고 챔버 가장자리에 몇 마이크로리터를 적용합니다. 모세관 힘을 통해 챔버가 완전히 채워지도록 합니다.

그런 다음 광학 현미경의 적절한 대물렌즈를 사용하고 계수 챔버 그리드 라인에 초점을 맞춥니다. 주어진 셀 크기에 적합한 사각형의 셀을 계산합니다. 입자 계수에 의한 정량화의 경우 샘플의 광학 밀도를 0.1로 조정하십시오.

그런 다음 10마이크로리터의 샘플을 10ml의 등장계 측정 버퍼에 추가합니다. 샘플 컵의 뚜껑을 고정하고 샘플을 혼합합니다.amp컵을 약간 기울여 부드럽게 le. 샘플 컵을 입자 계수기에 넣은 후 사용된 셀에 적합한 기공 크기의 모세관을 샘플 컵에 삽입하고 기계의 도어를 닫습니다.

측정을 시작하고 적절한 범위에서 기록하십시오. 이 단계에서 서로 다른 세포 크기를 가진 세포를 구별할 수 있습니다. single-cell 유세포 분석에 의한 정량화를 위해 샘플의 광학 밀도를 조정하여 세포 분석 측정에 적합하도록 정렬합니다.

세포 수가 1, 000에서 10, 분당 10 마이크로 리터의 유속으로 초당 000 세포의 범위 내에 유지되도록 주어진 공식을 적용하십시오. 각 샘플 셀 현탁액 300마이크로리터를 96웰 플레이트의 개별 웰로 옮깁니다. 그런 다음 96-well 플레이트를 세포 분석기의 자동 샘플로 옮깁니다.

샘플과 관련된 형광 및 산란 채널에 대한 열린 점도표와 히스토그램. 세포 농도를 확인하려면 record 기능을 사용하여 정의된 샘플 부피를 기록하십시오. APC-H 채널의 히스토그램을 사용하여 광영양 유기체의 적색 자가형광을 기반으로 광영양 유기체와 종속영양 유기체에 대한 신호를 분리합니다.

그런 다음 종속영양 집단만 표시하는 FITC-H 채널의 히스토그램을 사용하여 녹색 형광 단백질을 포함하는 종속영양 세포를 식별합니다. PC5.5-H 채널의 히스토그램을 사용하여 적색 형광 단백질을 포함하는 종속영양 세포와 그렇지 않은 세포를 구별합니다.