Name: Assembly and Quantification of Co-Cultures Combining Heterotrophic Yeast with Phototrophic Sugar-Secreting Cyanobacteria(종속영양 효모와 광영양성 설탕 분비 시아노박테리아를 결합한 공동 배양의 조립 및 정량화) (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-12-27T13:20:00.000+00:00
Duration: 5 min 44 s
Description: 배우세요 설탕 분비 시아노박테리아와 종속영양 효모를 결합한 공동 배양의 조립 및 정량화 방법을 통해 미생물 네트워킹을 이해하고 생명공학 응용을 최적화하는 기술을 습득하세요.

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<meta charset="utf8"></head><body>진균 파트너와 함께 자당을 분비하는 시아노박테리아를 공동 배양하기 위한 프로토콜

<table><tbody><tr><td>10x Ph1 대물렌즈</td><td>Carl Zeiss AG</td><td>46 04 01-9904</td><td></td></tr><tr><td>525/40nm 대역통과 필터</td><td>Beckman Coulter, Inc.</td><td>A01-1-0051</td><td>FITC 필터 (488nm 레이저)</td></tr> <tr><td>660/10nm 대역 통과 필터</td><td>Beckman Coulter, Inc.</td><td>A01-1-0055</td><td>APC 채널 (638nm 레이저)</td></tr> <tr><td>710/50nm 대역 통과 필터</td><td>Beckman Coulter, Inc.</td><td>B71092</td><td>PC5.5 채널(561nm 레이저)</td></tr><tr><td>멀티사이저 4e용 Accuvettes</td><td>Beckman Coulter, Inc.</td><td>A35473</td><td>뚜껑이 있는 샘플 컵</td></tr><tr><td>조리개 튜브 30 &mu; 멀티사이저 4e</td><td>Beckman Coulter, Inc.</td>의 경우 M<td>C92760</td><td>Capillary</td></tr><tr><td>Autoclave</td><td>Lab Associates</td><td>EQM-ARBP</td><td>재료 살균용</td></tr><tr><td>배플 플라스크 ROTILABO&reg;, 스트레이트 넥, 250ml</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td><td>LY95.1</td><td></td></tr><tr><td>BG11 / CoYBG11 구성 요소</td><td>다른 공급업체</td><td></td>는 <td>표 1 참조&nbsp;</td></tr><tr><td>보틀탑 멸균 필터</td><td>Sigmaaldrich</td><td></td>는 오토클레이브 Capillary 45 &micro를 <td>사용하고 싶지 않은 경우 멸균 매체에</td>Z222593</tr>.<tr><td> m</td><td>Omni Life Science</td><td>OLS 5651738</td><td></td></tr><tr><td>CASY Cell Counter Model TTC</td><td>Schaerfe Systems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CASY 컵</td><td>Omni Life Science</td><td>OLS 5651794</td><td></td></tr><tr><td>CASYclean</td><td>Omni Life Science</td><td>OLS 5651786</td><td>Cleaning solution</td></tr><tr><td>CASYton solution</td><td>Omni Life Science</td><td>OLS 5651808</td><td>Isotonic solution&nbsp;</td></tr><tr><td>원심분리기 튜브(50mL)</td><td>Sigmaaldrich</td><td>CLS430828</td><td></td></tr><tr><td>CO2</td><td>BOC</td><td>270182-L</td><td>, 시아노박테리아 액세닉 배양 및 공동 배양</td></tr><tr><td>공급CONTRAD&reg; 70</td><td>Beckman Coulter, Inc.</td><td>81911</td><td>딥 클린 솔루션</td></tr><tr><td>커버 유리 20 &times; 26 x 0.4 mm</td><td>VWR International GmbH</td><td>631-1190</td><td>챔버 카운팅 큐벳용 커버 유리</td></tr><tr><td></td><td>Sarstedt&nbsp;</td><td>67.742</td><td></td></tr><tr><td>시아노박테리아 BG-11 담수 솔루션</td><td>Merck KGaA</td><td>C3061</td><td></td></tr><tr><td>CytExpert 소프트웨어 v. 2.6</td><td>Beckman Coulter, Inc.</td><td></td><td>사이토미터 응용 소프트웨어</td></tr><tr><td>CytoFLEX Sheath Fluid</td><td>Beckman Coulter, Inc.</td><td>B51503</td><td>속수 유체</td></tr><tr><td>세포분석기 CytoFLEX S</td><td>Beckman Coulter, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BE51180 DxH 클리너 Multisizer 4e</td><td>Beckman Coulter, Inc.</td><td>628022</td><td>세정액</td></tr><tr><td>Eppendorf tube centrifuge (small)</td><td>Labstac</td><td>CEN16-15</td><td>to centrifuge of 2mL in culture</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td><td>K928.1</td><td></td></tr><tr><td>FACS tubes</td><td>Beckman Coulter, Inc.</td><td>반자동 모드용</td> <td>2523749</td></tr>관 <tr><td>FlowClean 세척제, 500ml</td><td>Beckman Coulter, Inc.</td><td>C48093</td><td>일일 청정 용액</td></tr><tr><td>매체 준비를위한</td><td>눈금 실린더</td><td>Sigmaaldrich</td><td>Z131121</td></tr><tr><td>HEPPSO</td><td>Merck KGaA</td><td>R426725</td><td></td></tr><tr><td>Infors MultiTron 광 배양기</td><td>Infors AG</td><td></td><td>백색 LED 조명</td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Merck KGaA</td><td>I6758</td><td>부분 표본을 준비하고 -20 °deg에서 보관하십시오. C, 해동하고 얼음에 보관&nbsp;</td></tr><tr><td>멀티사이저 4e용 Isoton II</td><td>Beckman Coulter, Inc.</td><td>8448011</td><td>등장성 용액&nbsp;</td></tr><tr><td>Kaluza 대 2.2</td><td>Beckman Coulter, Inc.</td><td>B16406</td><td>세포 분석 데이터 분석 소프트웨어</td></tr><tr><td>KimWipes</td><td>VWR International GmbH</td><td>115-2221</td><td>보푸라기 없는 티슈</td></tr><tr><td>KOH</td><td>Merck KGaA</td><td>221473</td><td></td></tr><tr><td>KPO3</td><td>Noah Chemicals</td><td>7790-53-6</td><td></td></tr><tr><td>측정 비커</td><td>VWR</td><td>213-3747</td><td></td></tr><tr><td>마이크로 테스트 플레이트, 96 웰, 슬립온 뚜껑, 평평한 바닥, PS, 투명</td><td>SARSTEDT AG & Co.</td><td>KG 82.1581.001</td><td></td></tr><tr><td>현미경 베이스</td><td>Carl Zeiss AG</td><td>47 09 18-9902/16</td><td></td></tr><tr><td>마이크로솝 헤드</td><td>Carl Zeiss AG</td><td>47 30 14</td><td></td></tr><tr><td>Milli-Q 정수 시스템</td><td>Merck Millipore</td><td>C85358</td><td></td></tr><tr><td>Mulitisizer 4e 입자 계수기</td><td>Beckman Coulter, Inc.</td><td>CASY Cell Counter의 대안</td>인 <td>B23005</td></tr><tr><td>Neubauer 개선, 깊이 0.02mm</td><td>독일</td><td></td><td>보조 챔버</td></tr><tr><td>Neubauer 개선, 깊이 0.1mm</td><td>Paul Marienfeld GmbH & Co. KG</td><td>640010</td><td>계수 챔버</td></tr><tr><td>즉시 사용 가능 QC Fluorospheres</td><td>Beckman Coulter, Inc.</td><td>QC</td>SCHOTT 병에 대한 <td>C65719</td> 참조</tr><tr><td></td><td>Dutscher</td><td>90347</td><td>보관용</td></tr><tr><td>Specord&reg; 200 Plus 분광 광도계</td><td>Analytic Jena GmbH</td><td></td><td>OD600/750</td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Merck KGaA</td><td>84100</td><td></td></tr><tr><td>탁상용 원심분리기(대)</td><td>Labstac</td><td>CEN18-06R</td><td>배양 바이오매스</td></tr><tr><td>효모 질소 염기, 아미노산 없음, 황산암모늄</td> 없음 <td>Thermo Fisher Scientific Inc.</td><td></td><td></td>11743014</tr></tbody></table>

assembly and quantification of co-cultures combining heterotrophic yeast with phototrophic sugar-secreting cyanobacteria(종속영양 효모와 광영양성 설탕 분비 시아노박테리아를 결합한 공동 배양의 조립 및 정량화)

Assembly and Quantification of Co-Cultures Combining Heterotrophic Yeast with Phototrophic Sugar-Secreting Cyanobacteria

phototrophic S. elongatus 및 종속영양 효모의 공동 배양 확립 우리는 이전에 Synechococcus elongatus PCC 7942와 S. cerevisiae의 다양한 아종을 공동 배양하여 상세한 결과를 보고한 바 있습니다. 이 시아노박테리아/효모 쌍을 사용한 공동 배양 결과에 대한 포괄적인 설명은8을 참조하십시오. 간결성과 정확성을 위해 이러한 결과는 여기에 재현되지 않습니다. 간단히 말해서, 이전 결과는 장기적인 시아노박테리아-효모 공동 배양을 확립하는 데 중요한 여러 고려 사항을 나타냅니다. 주요 관심사는 시아노박테리아가 고정 탄소의 유일한 형태를 제공하는 조건에서 효모가 생존할 수 있는 능력은 효모 균주가 자당을 활용할 수 있는 효율성에 크게 의존한다는 것입니다. 자당을 보다 효율적으로 대사하도록 진화하거나 조작된 S. cerevisiae 균주27,28은 공동 배양 성장 모드로의 전환에서 생존할 가능성이 더 높았고, 더 높은 세포 밀도를 달성했으며, 장기(며칠에서 몇 주) 시아노박테리아 공동 배양 실험에서 더 높은 견고성을 보여주었습니다8. 공동 배양을 접종하는 초기 단계는 효모 생존력에 특히 중요했는데, 이는 배양 희석, 배지 조성 전환 및/또는 더 농축된 탄소원의 회수에 대한 스트레스 때문일 수 있습니다. 따라서 공동 배양 시작 시 더 풍부한 성장 배지에서 최소 탄소 가용성으로 쉽게 전환하기 위한 노력은 실험 성능과 일관성을 향상시킬 수 있습니다(1.2.1.1 단계 참조). 또한, S. cerevisiae는 S. elongatus의 조밀한 배양물에 접종되었을 때 고산소와 일치하는 스트레스 반응을 보였으며, 이는 산소 광합성의 주요 부산물인 O2의 형성과 일치했습니다. 그러므로, 시아노박테리아 파트너의 과다 증식 및/또는 "낮/밤" 빛의 순환을 번갈아 가며 방지하려는 노력은 장기적인 공동 배양에서 S. cerevisiae의 생존 가능성을 실질적으로 연장할 수 있습니다. Discussion section(논의 섹션)에서 axenic control samples와 관련된 공동 배양에서 흔히 발생하는 현상에 대한 추가 요약을 참조하십시오.
다양한 방법론을 사용한 공동 배양의 성장 모니터링 다음 섹션에서는 세 가지 다른 방법을 사용하여 Synechocystis와 두 개의 효모 S. cerevisiae와 U. maydis의 인위적으로 혼합된 삼자 컨소시엄의 예시적인 정량화가 설명됩니다. 혼합물에 대해 단일 배양의 OD750(시아노박테리아의 경우) 및 OD600(종속영양의 경우)을 측정하고 OD 0.1로 조정했습니다. 단일 배양물은 광학 밀도를 사용하여 1:1:1의 비율로 혼합되었습니다(이는 세포 수와 구별되며, 위 참조). 세포분석기에서 효모의 구별을 용이하게 하기 위해, 세포질 mKate2 (유전자형: URA3Δ/pTDH3::mKate2; 균주: S. cerevisiae mKate230)를 구성적으로 생산하는 유전자 변형 S. cerevisiae FY1679-O1B29 및 구조적으로 eGFP를 생산하는 U. maydis 균주 AB3331 (유전자형: pep4Δ/pRpl40::egfp; 균주: U. maydis eGFP32)가 사용되었습니다. 주목할 점은 시아노박테리아 균주에는 노란색 형광 단백질 버전 mVenus(Synechocystis sp. PCC 6803 pSHDY-Pcpc560-mVenus, 균주 Synechocystis mVenus,33)과 유사하며, 또한 광합성 기계의 존재로 인해 전형적인 강한 자가형광을 나타낸다.
계수 챔버를 사용한 현미경 정량화: 3 가지 미생물의 인공 혼합물에 사용되는 모든 세포 유형은 현미경으로 쉽게 구별 할 수 있습니다 (그림 2A) : Synechocystis와 S. cerevisiae 는 직경이 크게 다른 구형 세포로 대표되지만 (Synechocystis : 약 직경 1.5-3 μm, S. cerevisiae : 약 직경 3-6 μm), U. maydis 세포는 길쭉한 시가 모양의 형태와 길이가 최소 10 μm (그림 2A)). 이러한 명확한 형태학적 특성으로 인해 혼합물의 각 파트너를 정확하게 정량화할 수 있습니다. 예시적인 예로, 37, 18, 36 및 21 S. cerevisiae 세포가 각각 4개의 큰 사각형에 계수됩니다(그림 2B). 평균값은 28개의 셀입니다. 사용된 혈구계의 큰 정사각형은1mm2 의 면적을 가지며 챔버 깊이가 0.02mm이기 때문에 0.02μL당 28개의 세포가 생성됩니다. 이는 1,400 cells/μL에 해당하며, 이는 1.4 x 106 cells/mL에 해당합니다. 다른 세포 유형을 세고 그에 따라 농도를 측정했습니다(그림 2C, 표 2).
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67311/67311fig02.jpg"> 
그림 2: Synechocystis와 효모 S. cerevisiae 및 U. maydis로 구성된 삼자 컨소시엄의 현미경 정량화. (A) 표시된 미생물의 인위적으로 결합된 혼합물의 현미경 차등 대비(DIC) 이미지. 모든 종은 형태에 따라 쉽게 구별 할 수 있습니다. 스케일 바 : 10 μm. (B) OD가 0.1 인 axenic cultures를 기반으로 표시된 균주의 인위적으로 조립 된 혼합물에 대한 예시 계산 결과. 그리드 가장자리에 있는 4개의 큰 사각형을 분석했습니다( 그림 1D의 빨간색 표시). (C) 4개의 정사각형에서 계수된 서로 다른 세포의 평균값은 다음 방정식을 사용하여 현탁액 내 세포의 농도를 계산하는 데 사용되었습니다: 평균값/(챔버 깊이[0.02mm] x 계수된 정사각형의 크기[1mm,2] x 1,000). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67311/67311fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
입자 계수기를 사용한 정량화: 파티클 카운터는 크기에 따라 현탁액의 파티클 수를 결정합니다. 예제 데이터 세트에서는 45μm 모세관이 있는 입자 계수기가 사용되었습니다. S. cerevisiae 와 U. maydis 세포는 유사한 치수를 나타내기 때문에 입자 계수기에서 구별할 수 없지만 더 작은 Synechocystis 세포는 명확하게 분리할 수 있습니다. 따라서 단일 배양물을 분석하면 두 효양에 대해 3-6μm를 참조하는 동일한 위치에서 피크가 나타납니다(그림 3A). 측정하는 동안 음압이 가해져 세포가 모세혈관으로 들어갑니다. 이것은 장치가 변경에 따라 입자 크기를 결정할 수 있도록 전기 저항을 잠시 변경합니다. 혼합 배양액에서 두 개의 뚜렷한 피크를 검출할 수 있는데, 하나는 더 작은 시아노박테리아 세포와 관련이 있고 다른 하나는 두 효모 종의 결합 분획을 나타냅니다(그림 3B). 중요한 것은 살아있는 세포를 반영하는 피크 외에도 세포 파편과 더 작은 입자에 해당하는 약 1μm(그림 3)에서 추가 피크가 검출되었다는 것입니다. 예상보다 큰 직경에서 나타나는 신호는 세포 응집으로 인해 발생할 수 있습니다. 주목할 점은 피크의 모양이 세포의 균질성을 반영한다는 것입니다: 날카로운 피크는 매우 균질한 세포를 보여주며, 이는 공동 배양에 적합하지 않습니다. 공동 문화에서는 매우 넓은 정점 또는 공동 문화의 파트너가 분명히 크기가 다른 경우 두 개의 정점을 볼 수 있을 것으로 예상됩니다. 종속영양 균류의 축삭 배양의 경우, 봉우리는 중간 너비의 봉우리일 수 있습니다.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67311/67311fig3v2.jpg"> 
그림 3: 입자 계수기를 사용하여 Synechocystis mVenus와 효모 S. cerevisiae mKate2 및 U. maydis eGFP로 구성된 삼자 컨소시엄의 정량화. (A) 그래프에 표시된 대로 세 가지 균주의 축삭 배양 분석의 시각적 출력(45μm 모세관이 있는 세포 계수기). (B) 동일한 조건을 사용하는 인공 삼자 컨소시엄의 분석을 위한 예시적인 시각적 출력 파일. 입자 계수기는 두 번째 피크로 표시되는 두 효모 종의 구별을 지원하지 않습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67311/67311fig3v2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
단세포 세포 분석을 사용한 정량화: single-cell 유세포분석기를 사용하면 (자동) 형광 및 광 산란 특성에 따라 다양한 세포 집단을 쉽게 구별할 수 있습니다. 광영양 세포(Synechocystis)는 APC-H 채널에서 측정된 광합성 색소의 적색 자가형광을 기반으로 종속영양 세포(U. maydis 및 S. cerevisiae)와 구별할 수 있습니다(그림 4A). 광영양 세포와 종속영양 세포의 초기 분리를 기반으로 두 종속영양 집단은 FITC-H 채널의 형광 마커 eGFP와 PC5.5 채널의 mKate2를 기반으로 구별할 수 있습니다(그림 4B, C). 세 개체군(FSC-H 및 FSC-Width) 모두의 산란 특성을 보여주는 점도표에서 개체군은 개체군의 일부 미미한 중복만으로 구별할 수 있습니다(그림 4D).
이 방법을 사용하여 희석된 샘플 중 10μL를 10μL/분의 유속으로 분석하여 1분 내에 약 70,000개의 세포를 정량화할 수 있었습니다. 이러한 세포의 약 60%는 Synechocystis (4.23 x 106 cells/mL)에 할당될 수 있었고, 나머지 40%는 U. maydis (1.35 x 106 cells/mL)와 S. cerevisiae (1.36 x 106 cells/mL, 그림 4E, 표 2)에 균등하게 분포되었습니다.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67311/67311fig04.jpg"> 
그림 4: 단일 세포 유세포 분석을 사용한 cyanobacterium Synechocystis mVenus와 효모 U. maydis eGFP 및 S. cerevisiae mKate2로 구성된 삼자 컨소시엄의 정량화. APC-H 채널(예: 638 nm, em.: 660/10 nm)의 모든 세포는 자가형광에 따라 광영양 세포와 종속영양 세포를 구별하는 데 사용됩니다. (B) 녹색 형광 특성에 따라 U. maydis eGFP 및 S. cerevisiae mKate2 세포를 구별하는 데 사용되는 모든 종속영양 세포의 FITC-H 채널(예: 488 nm, em.: 525/40 nm)의 이벤트 횟수 및 형광의 히스토그램. (C) 적색 형광 특성을 기반으로 U. maydis eGFP 및 S. cerevisiae mKate2 세포를 구별하는 데 사용되는 모든 종속영양 세포의 PC5.5-H 채널(예: 561nm, em.: 710/50nm)의 이벤트 횟수 및 형광의 히스토그램. (D) 형광 특성이 없는 세포 집단을 식별하는 데 사용되는 FSC-H 채널에 대한 FSC-Width의 산란 신호의 점도표. (E) 사건 수, 백분율, 산술 평균 및 관련 형광 채널의 표준 편차(SD)를 포함한 개체군 통계. 세포의 총 양은 크기 및 형광과 함께 10μL/분의 유속으로 10μL의 부피로 측정되었습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67311/67311fig04large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
서로 다른 정량화 방법의 출력을 비교적으로 시각화하기 위해 결정된 세포 수가 다음 두 표(표 2 및 표 3)에 제시되어 있습니다. 앞서 설명한 세 가지 방법을 사용하여 측정된 세포의 최종 농도는 모든 방법에 대해 유사한 범위에 있습니다. 유세포 분석기는 가장 높은 샘플 크기를 제공하고 입자 계수기와 현미경 정량화가 그 뒤를 잇며, 두 방법 간에 약 한 자릿수 감소합니다.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="2">공동 문화 1:1:1</td>
			<td>광도 계</td>
			<td colspan="2">세포분석기</td>
			<td colspan="2">입자 계수기</td>
			<td colspan="2">현미경 카운팅 챔버</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">유기체</td>
			<td>외경750/600</td>
			<td>세포 수</td>
			<td>세포/mL</td>
			<td>세포 수</td>
			<td>세포/mL</td>
			<td>세포 수</td>
			<td>세포/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Saccharomyces cerevisiae mKate2</td>
			<td>0.0333</td>
			<td>13,618</td>
			<td>1.36 엑스 106</td>
			<td rowspan="2">1,546*</td>
			<td rowspan="2">2.58 x 106*</td>
			<td>112</td>
			<td>1.40 엑스 106</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Ustilago maydis eGFP</td>
			<td>0.0333</td>
			<td>13,541</td>
			<td>1.35 엑스 106</td>
			<td>89</td>
			<td>1.11 엑스 106</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Synechocystis sp. PCC 6803 m금성</td>
			<td>0.0333</td>
			<td>42,330</td>
			<td>4.23 엑스 106</td>
			<td>3,094</td>
			<td>5.16 엑스 106</td>
			<td>271</td>
			<td>3.39 엑스 106</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
표 2: 다양한 정량화 방법의 비교: 인공 혼합 배양. U. maydis와 S. cerevisiae는 입자 계수기(*)를 사용하여 구별할 수 없습니다.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="2">단일 문화권</td>
			<td>광도 계</td>
			<td colspan="2">세포분석기</td>
			<td colspan="2">입자 계수기</td>
			<td colspan="2">현미경 카운팅 챔버</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">유기체</td>
			<td>외경750/600</td>
			<td>세포 수</td>
			<td>세포/mL</td>
			<td>세포 수</td>
			<td>세포/mL</td>
			<td>세포 수</td>
			<td>세포/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Saccharomyces cerevisiae mKate2</td>
			<td>0.1</td>
			<td>38,936</td>
			<td>3.89 엑스 106</td>
			<td>1,928</td>
			<td>3.21 엑스 106</td>
			<td>403</td>
			<td>4.03 엑스 106</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Ustilago maydis eGFP</td>
			<td>0.1</td>
			<td>36,927</td>
			<td>3.69 엑스 106</td>
			<td>2,465</td>
			<td>4.11 엑스 106</td>
			<td>307</td>
			<td>3.07 엑스 106</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Synechocystis sp. PCC 6803 m금성</td>
			<td>0.1</td>
			<td>127,864</td>
			<td>1.28 엑스 107</td>
			<td>8,186</td>
			<td>1.36 엑스 107</td>
			<td>428</td>
			<td>1.07 엑스 107</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
표 3: 다양한 정량화 방법 비교: 단일/축성 배양을 사용한 보정.

Assembly and Quantification of Co-Cultures Combining Heterotrophic Yeast with Phototrophic Sugar-Secreting Cyanobacteria(종속영양 효모와 광영양성 설탕 분비 시아노박테리아를 결합한 공동 배양의 조립 및 정량화)

With the increasing demand for sustainable biotechnologies, mixed consortia containing a phototrophic microbe and heterotrophic partner species are being ...

본 연구는 자당을 분비하는 시아노박테리아(cyanobacteria)와 종속영양균(heterotrophic fungi)을 포함하는 합성 컨소시엄의 미생물 네트워킹을 이해하는 것을 목표로 합니다. 과거에는 미생물학자들이 보통 단일 미생물의 순수 배양을 연구했습니다. 그러나 자연에서 미생물은 일반적으로 컨소시엄에서 발생하므로 혼합 배양에서의 미생물 네트워킹을 이해하는 것도 필수적입니다.한 가지 주요 과제는 모든 컨소시엄 구성원의 성장을 허용하는 매체를 포함하여 적절한 성장 조건을 찾는 것입니다. 여기서 우리는 주로 종속영양 부재의 성장에 기초를 제공하는 광영양 부재에 의한 가장 높은 자당 생성 및 분비를 최적화하는 데 중점을 둡니다. 액세닉 배양(axenic culture)의 성장을 추적하기 위해 광학 밀도 또는 후방 산란 측정과 같은 일반적인 기술을 사용할 수 있습니다.그러나 이러한 기술은 개별 종의 세포 수가 필요한 공동 배양에는 적용되지 않습니다. 당사의 프로토콜에서는 형광 표지와 세포 계수의 조합을 적용하여 서로 다른 공동 배양 파트너를 구별합니다. 또한 간단하고 저렴한 비용에서 비용이 많이 들고 처리량이 많은 방법에 이르기까지 다양한 방법으로 유사한 결과를 얻을 수 있음을 보여줄 수 있습니다.시작하려면 3일 동안 배양액을 성장시킨 후 시아노박테리아 세포를 펠렛화합니다. 펠릿을 25ml의 멸균 CoYBG-11 배지에 재현탁합니다. 4, 실온에서 20분 동안 000g에서 샘플을 원심분리하십시오.그런 다음 디캔팅으로 상등액을 버립니다. 광학 밀도가 결정되면 멸균 조건에서 250ml 배플 플라스크에 계산된 양의 CoYBG-11을 추가합니다. 그 후, 계산된 시아노박테리아 및 종속영양 세포 현탁액을 추가하여 50ml의 최종 배양 부피를 얻습니다.50ml 배양을 위해 1몰 IPTG 스톡에서 50마이크로리터를 사용합니다. 그런 다음 플라스크를 초당 평방 미터당 약 200마이크로몰 광자로 광자세척기에 넣습니다. 섭씨 30도에서 2%의 이산화탄소, 150RPM에서 궤도 흔들림, 75%의 습도로 환경을 보충합니다.샘플링을 위해 인큐베이터에서 플라스크를 꺼내 멸균 조건에서 배양액에서 1ml 샘플을 채취합니다. 현미경 정량화를 준비하려면 계수 챔버와 커버 유리에 먼지와 세포가 없는지 확인하십시오. 파손을 피하면서 약간의 압력으로 두 개의 지지대에 커버 유리를 밀어 넣어 올바르게 배치하십시오.커버 유리가 제대로 배치되면 커버 유리가 미끄러지지 않는지 확인하면서 두 유리 표면 사이에 있는 뉴턴의 고리를 관찰합니다. 이제 세포 현탁액을 철저히 혼합하고 챔버 가장자리에 몇 마이크로리터를 적용합니다. 모세관 힘을 통해 챔버가 완전히 채워지도록 합니다.그런 다음 광학 현미경의 적절한 대물렌즈를 사용하고 계수 챔버 그리드 라인에 초점을 맞춥니다. 주어진 셀 크기에 적합한 사각형의 셀을 계산합니다. 입자 계수에 의한 정량화의 경우 샘플의 광학 밀도를 0.1로 조정하십시오.그런 다음 10마이크로리터의 샘플을 10ml의 등장계 측정 버퍼에 추가합니다. 샘플 컵의 뚜껑을 고정하고 샘플을 혼합합니다.amp컵을 약간 기울여 부드럽게 le. 샘플 컵을 입자 계수기에 넣은 후 사용된 셀에 적합한 기공 크기의 모세관을 샘플 컵에 삽입하고 기계의 도어를 닫습니다.측정을 시작하고 적절한 범위에서 기록하십시오. 이 단계에서 서로 다른 세포 크기를 가진 세포를 구별할 수 있습니다. single-cell 유세포 분석에 의한 정량화를 위해 샘플의 광학 밀도를 조정하여 세포 분석 측정에 적합하도록 정렬합니다.세포 수가 1, 000에서 10, 분당 10 마이크로 리터의 유속으로 초당 000 세포의 범위 내에 유지되도록 주어진 공식을 적용하십시오. 각 샘플 셀 현탁액 300마이크로리터를 96웰 플레이트의 개별 웰로 옮깁니다. 그런 다음 96-well 플레이트를 세포 분석기의 자동 샘플로 옮깁니다.샘플과 관련된 형광 및 산란 채널에 대한 열린 점도표와 히스토그램. 세포 농도를 확인하려면 record 기능을 사용하여 정의된 샘플 부피를 기록하십시오. APC-H 채널의 히스토그램을 사용하여 광영양 유기체의 적색 자가형광을 기반으로 광영양 유기체와 종속영양 유기체에 대한 신호를 분리합니다.그런 다음 종속영양 집단만 표시하는 FITC-H 채널의 히스토그램을 사용하여 녹색 형광 단백질을 포함하는 종속영양 세포를 식별합니다. PC5.5-H 채널의 히스토그램을 사용하여 적색 형광 단백질을 포함하는 종속영양 세포와 그렇지 않은 세포를 구별합니다.

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생명공학

출처: Jiang, H., Ho, M. 시아노박테리아에서 온전한 피코빌리좀의 분리 및 특성화. J. Vis. Exp.(2021).이 비디오는 이산화탄소 공급과 영양이 풍부한 조건으로 지속적인 조명 하에서 세포를 성장시킨 다음 원심분리를 통해 수확하여 바이오매스를 얻기 위해 시아노박테리아를 배양하는 절차를 보여줍니다.

바이오매스 생산을 위한 시아노박테리아 배양 준비

우리는 거꾸로 현미경으로 유출 물에 미생물의 문화와 정기적으로 이미지 세포를 조명하기 optogenetic 시스템과 함께 사용 연속 배양 장치를 설계했다. 조명 동적 응답은 며칠에 걸쳐 측정 될 수 있도록 배양 샘플링, 촬상 한 화상 분석이 완전 자동화된다.

미생물 Optogenetic 애플리케이션을위한 설계 및 자동화 일루미, 배양 및 샘플링 시스템의 구현

여기서, 우리는 i) CyanoGate 모듈식 클로닝 툴킷을 사용하여 자가 복제 벡터를 조립하는 방법을 설명하는 프로토콜을 제시하고, ii) 컨쥬게이션에 의해 시아노박테리아 숙주에 벡터를 도입하고, iii) 형질전환 시아노박테리아 균주를 특성화한다. 플레이트 리더 또는 유세포 분석.

시안게이트 모듈형 복제 툴킷을 사용하여 컨쥬게이션에 의한 시아노박테리아의 유전자 변형

우리는 효모 사카로미세스 세레바시아에있는 수용성 대사산물의 주요 클래스의 식별 그리고 양을 위한 프로토콜을 제시합니다. 설명된 방법은 다재다능하고 견고하며 민감합니다. 그것은 서로 수용성 대사 산물의 구조 이소목 및 고정 관형 형태의 분리를 허용한다.

탠덤 질량 분광과 결합 된 액체 크로마토그래피를 사용하여 사카로미세스 Cerevisiae의 정량적 Metabolomics

미생물 대사의 광유전학적 조절은 발효 과정에 대한 유연한 동적 제어를 제공합니다. 여기의 프로토콜은 다양한 부피 규모에서 화학 및 단백질 생산을위한 청색광 조절 발효를 설정하는 방법을 보여줍니다.

미생물 화학 및 단백질 생산을 위한 광 조절 발효

현재 프로토콜은 불연속 자당 밀도 그라데이션을 통해 원심분리에 의한 시아노박테리아로부터의 피코빌리좀의 분리를 자세히 설명합니다. 그대로 피코빌리좀의 분획은 77K 형광 스펙트럼 및 SDS-PAGE 분석에 의해 확인된다. 결과 물리경분획은 TEM 및 질량 분광법 분석의 음수 염색에 적합합니다.

시아노박테리아의 피코빌리좀의 격리 및 특성화

이 연구에서 주요 목적은 탄소 나노튜브(CNT)의 세포 흡수와 최종 엑소사이토시스를 모니터링하는 것이었습니다. 이러한 관점에서, 우리는 통계적으로 유의미한 수의 세포에서 CNT의 정량화 및 국소화를 허용하는 다중 스펙트럼 이미징 유세포 분석을 사용하는 고유한 방법을 제안했습니다.

멀티 스펙트럼 이미징 유동 세포 계측법과 세포의 현지화 및 탄소 나노 튜브의 상대 정량

단일 또는 다수의 세포 외 기질 단백질로부터 나노 섬유 및 나노 구조 복합체를 얻는 방법을 설명한다. 이 방법은 조직 공학 및 생명 공학 응용 프로그램의 다양한 사용을위한 조정 가능한 구성과 아키텍처 무료 서 단백질 계 물질을 생성하는 단백질 표면의 상호 작용을 사용합니다.

ECM 단백질 나노 섬유 및 나노 구조 엔지니어링 사용하여 표면 시작 회의

지원되는 지질 이중층과 천연 막 입자는 세포막의 특성을 근사 할 수 있고 분석 다양한 전략에 통합 될 편리한 시스템이다. 여기에서 우리는 지원 지질 이중층 코팅 된 SiO2로 비즈, 인지질 막 소포 또는 천연 입자로 구성된 마이크로 어레이를 제조하는 방법을 보여준다.

스퀴지 기반의 조립 방법과 생체막 마이크로 어레이의 형성

이 논문은 내피 세포의 생리 학적 특성을 요점을 되풀이 미세 혈관을 설계하는 사출 성형 방법을 제공한다. 미세 유체 기반의 공정은 흐름, 세포 성분, 형상, 생화학 그라디언트로 테일러 조건과 특허 3 차원 혈관 네트워크를 생성합니다. 제조 공정 및 잠재적 응용 예들이 설명된다.

미세화 및 3D 미세 혈관의 조립

배우세요 설탕 분비 시아노박테리아와 종속영양 효모를 결합한 공동 배양의 조립 및 정량화 방법을 통해 미생물 네트워킹을 이해하고 생명공학 응용을 최적화하는 기술을 습득하세요.

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