저비용 폴리에틸렌 테레프탈레이트 라미네이션 미세유체역학(Low-cost Polyethylene Terephthalate Lamination Microfluidics) 설계로 멀티플렉스 제브라피시 이미징

우리 연구실은 상처 치유에서 세포내 칼슘 신호 전달의 특성과 생물학적 중요성에 중점을 두고 조직 손상, 감염 및 암에서 호중구 이동 및 활성화를 조절하는 메커니즘에 관심이 있습니다.

[셸리] 기존의 미세유체 설계 방법은 비용이 많이 들고 복잡하기 때문에 다양한 환경이 필요한 발달 생물학과 같은 분야의 발전이 느려집니다. 우리는 개별 설계를 개발하고 테스트하기 위한 보다 빠르고 효율적인 접근 방식을 보았습니다. 따라서 이 구성 방법은 유사하게 간단한 프로토콜보다 더 큰 설계 유연성과 공간 분해능을 제공하는 동시에 표준 PDMS 장치보다 더 빠르고 쉬운 반복을 가능하게 합니다. 이를 사용하여 단일 시야 내에서 여러 제브라피쉬 배아를 동시에 이미지화하는 RADISH를 개발했습니다.

고해상도 생명 이미징을 지원하는 이 포획 장치를 통해 우리는 화학적 및 기계적 자극을 포함한 다양한 신호가 염증과 상처 치유를 조정하기 위해 어떻게 통합되는지 이해할 수 있습니다.

[강사] 시작하려면 선택한 소프트웨어를 사용하여 장치의 패턴을 디자인합니다. 배아의 나이와 크기에 따라 채널의 너비와 중앙 이미징 챔버의 크기를 조정하여 가장 잘 맞습니다. 각 레이어를 동일한 크기의 개별 이미지 파일로 저장합니다. 이제 제조업체의 지침에 따라 절단기를 초기화하십시오. 디자인 작업 영역에서 새로 업로드된 디자인을 선택합니다. 동일한 두께의 PET 시트를 위한 패턴을 동일한 컷에 함께 그룹화합니다. 절단된 패턴의 수와 유형을 확인한 다음 절단 재료를 선택합니다. 그런 다음 PET 시트를 원하는 두께로 절단 매트에 부착하여 기포를 단단히 눌러 기포를 제거한 후 매트를 절단기에 넣습니다. 화면의 지시에 따라 절단기에 절단을 시작하라는 메시지가 표시됩니다. 그런 다음 절단 매트에서 완성된 절단을 제거합니다. 이제 도움 없이 또는 미리 절단된 등록 표시와 함께 덮개 슬립 유리의 레이어를 정렬합니다. 라미네이션 중에 이동하지 않도록 사무용 테이프로 레이어를 고정하십시오. 장치 크기와 라미네이터 용량에 따라 라미네이터 피드가 걸리거나 막히는 것을 방지하기 위해 더 많은 테이프로 작은 디자인을 더 큰 뒷면에 장착하십시오. 그런 다음 라미네이터를 켜고 제조업체의 지침에 따라 라미네이트를 합니다. 다음 레이어를 정렬하기 전에 사무실 테이프를 제거합니다. 시아노아크릴레이트 접착제를 사용하여 3/4인치 구멍이 뚫린 35mm 접시에 장치를 고정합니다. 그런 다음 외부 장치 가장자리를 시아노아크릴레이트 접착제로 철저히 코팅하여 라미네이트를 방수합니다. 틈 없이 바깥쪽 가장자리를 완전히 덮을 수 있도록 충분한 접착제를 사용하십시오. 시작하려면 제브라피쉬 배아를 E3 또는 다른 적절한 배아 양육 배지에서 수정 후 최소 2일까지 키웁니다. 그런 다음 MS-222 리터당 164mg을 사용하여 배아를 마취합니다. 다음으로, 장착된 장치가 들어 있는 고정 접시에 5밀리리터의 E3 또는 MS-222 리터당 164밀리그램을 포함하는 다른 배아 배지를 채웁니다. 이송 피펫을 사용하여 마취된 배아 1개를 장치의 각 홀딩 챔버에 넣습니다. 그런 다음 헤어 루프를 사용하여 각 배아의 꼬리가 중앙 이미징 챔버로 돌출되고 난황이 쐐기 모양의 채널에 고정되도록 배아의 방향을 지정합니다. 원하는 경우 마이크로 피펫을 사용하여 1.5% 저융점 아가로스를 홀딩 챔버에 추가하여 배아의 머리를 고정합니다. 마지막으로 배아가 있는 장치를 선택한 이미징 시스템으로 이동하여 이미징을 시작하고 실험에 적합한 이미징 시스템과 목표를 선택합니다. 최적의 신호 대 잡음비 (signal to noise ratio) 및 획득 속도를 위해 샘플 초점 및 이미징 매개변수를 조정합니다. 수동 절개를 통해 배아에 상처를 입히려면 실체 현미경에서 척삭 끝의 꼬리지느러미 조직을 가로질러 메스 칼날로 압력을 가합니다. 그런 다음 장치를 스테이지로 되돌립니다. 레이저 자극을 통해 배아에 상처를 입히려면 꼬리지느러미 주름 가장자리 근처에 관심 영역을 정의하고 사용 가능한 레이저 출력에 따라 자극합니다. GFP 및 RFP 채널을 사용하여 총 1시간 동안 1분의 프레임 간격으로 실온에서 배아를 이미지화합니다. 필요한 경우 이송 피펫을 사용하여 머리 근처를 부드럽게 흡입하거나 접시를 소용돌이쳐 이미징 후 배아를 방출합니다.