Intravital Longitudinal Imaging of Vascular Dynamics in the Calvarial Bone Marrow(갈바리골수에서 혈관 역학의 생체 내 종단 영상)

본 연구는 혈관이 정상 및 병리학적 조혈에 어떻게 반응하는지 밝히는 것을 목표로 생체 현미경을 사용하여 골수 대환경의 혈관 역학을 이해하는 데 중점을 둡니다. 우리는 광현미경, 형질전환 동물 모델과 같은 고급 이미징 기술을 사용하고 추적자를 분석하여 시간 경과에 따른 살아있는 조직의 동적 혈관 변화를 시각화하고 정량화합니다. 주요 발전은 동물 복지를 개선하고 3R에 부합하기 위한 프로토콜의 개선입니다. 우리의 종단적 접근 방식은 수술 단계를 최소화하고 연구에 필요한 동물의 수를 크게 줄입니다.

우리의 프로토콜은 심부 조직 침투와 세포 거동 및 상호 작용의 고해상도 시각화를 가능하게 하는 2광자 현미경을 사용하여 무독성의 장기 생체 내 이미징의 필요성을 해결합니다. 3D 프린팅된 머리 임플란트를 사용하면 높이, 각도 또는 순서를 변경하지 않고도 세로 이미징 세션 중에 관심 영역을 매우 쉽게 찾을 수 있습니다. 우리는 현재 이 프로토콜을 사용하여 특정 내피 아형과 백혈병 발병 및 약물 치료에 대한 반응을 추적하여 질병 병인에 대한 기여도를 더 잘 이해하고 있습니다.

시작하려면 분할 소프트웨어를 실행하고 micro-CT DICOM 파일을 가져와 두개골을 분리합니다. 임계값 기반 분할을 수행하여 뼈 조직을 주변 구조에서 분리합니다. 복잡하거나 시끄러운 영역을 수동으로 조정하여 세분화를 구체화합니다.

3D 슬라이서에서 DICOM 파일을 가져오고 데이터 세트를 로드합니다. 축, 시상 및 관상 슬라이스 보기에서 CT 슬라이스를 관찰합니다. 세그먼트 편집기를 열고 추가 를 클릭하여 새 세그멘테이션을 만든 다음 추가 를 다시 클릭하여 임계값을 위한 새 세그먼트를 만듭니다.

세그먼트 편집기 패널에서 임계값 효과를 클릭합니다. 하한 및 상한 임계값 슬라이더를 조정하거나 숫자 값을 입력하여 분할된 영역을 빨간색으로 강조 표시합니다. 분할된 두개골을 stl 파일로 내보내려면 분할 모듈로 전환합니다.

임계값이 지정된 세그먼트가 선택되어 있는지 확인합니다. 내보내기/가져오기 모델 및 레이블맵 섹션에서 내보내기 유형을 모델로 설정하고 파일 형식을 stl로 설정한 다음 내보내기를 클릭하여 파일을 저장합니다. CAD에서 두개골 모델을 준비하려면 먼저 stl 형식의 단순화된 두개골 모델을 새 부품 또는 모델로 CAD 소프트웨어로 가져옵니다.

중앙 평면에서 두개골에 접하는 축을 만든 다음 준비된 두개골 모델을 저장합니다. 두개골 평면에 스케치를 만들고 AP 플러스 6.5에서 마이너스 2까지 배 모양의 스플라인을 디자인합니다. AP 0.0에서 너비가 6mm인 이 곡은 관측 가능한 표면 윤곽이 될 것입니다.

임플란트의 꼬리를 설계하여 사용 가능한 부피를 존중하면서 적절한 고정을 위해 두개골 구조에 맞는지 확인합니다. 마지막으로 사용하지 않을 때 관찰창을 보호하기 위해 보호 덮개를 만듭니다. 마취된 마우스를 섭씨 37도로 설정된 가열 패드 위에 놓고 호흡수를 육안으로 모니터링합니다.

전기 면도기로 마우스 머리를 면도하십시오. 그런 다음 안과용 젤 한 방울을 마우스의 눈에 바르십시오. 이미징 아티팩트를 방지하고 상처 감염 위험을 줄이기 위해 모든 머리카락을 제거했는지 확인하십시오.

이제 멸균 겸자와 가위를 사용하여 두피 중앙 부분을 작은 절개하여 중앙 뼈 흉터를 노출시킵니다. 두개골과 두피 사이의 결합 조직을 제거합니다. 페트리 접시에 충분한 치과용 시멘트를 섞어 페이스트를 만듭니다.

머리 고정 임플란트 바닥에 빠르게 적용하십시오. 치과용 시멘트가 영상 부위에 들어가지 않도록 헤드 홀더를 노출된 두개골에 놓고 굳히십시오. 현미경의 정위 마스크를 향한 이소플루란 흐름을 켭니다.

이제 마우스를 현미경으로 빠르게 가져옵니다. 한 손으로 코를 들어 올려 이소플루란이 제대로 침투하도록 마우스의 이빨을 마스크에 조심스럽게 삽입합니다. 한 손으로 마우스를 잡은 상태에서 다른 손을 사용하여 머리 고정 임플란트의 더브테일을 고정 홀더에 부드럽게 밀어 넣습니다.

나사 손잡이를 반 돌려 고정합니다. 다음으로, 마우스의 온도를 모니터링하기 위해 수성 젤이 미리 내장된 직장 프로브를 도입합니다. 헤드 이미징 챔버를 다량의 수성 젤(PBS)으로 채웁니다.

2광자 여기 중 최적의 여기 및 신호 감지를 위해 완전히 잠길 때까지 수침 대물렌즈를 낮춥니다. x, y 스테이지 및 z 드라이브를 움직여 비계 흉터의 중앙 뼈에 초점을 맞춥니다. 뼈 표면과 중심 정맥으로 표시된 조직을 식별합니다.

방의 조명을 끄고 현미경 스탠드 주변의 상자를 닫습니다. 비 TOSCAN 감지기를 활성화한 후. PMT1을 설정하여 423 - 461 나노미터에서 두 번째 SHG를 검출하고, 485 - 548 나노미터에서 GFP에 대해 높은 D2, 551 - 645 나노미터에서 TD D'Amato에 대해 높은 D3를 감지하도록 설정합니다.

오프셋을 0으로 둡니다. 이제 PMT SHG 이득을 850볼트로 설정하고 높은 D 이득을 100%로 설정합니다. 3개 채널 중 가장 낮은 채널에서 다이내믹 레인지가 200 그레이 레벨인 이미지가 보일 때까지 적외선 레이저 출력을 높입니다. 획득 소프트웨어에서 골수 주머니를 포함하는 로케이터 영역은 뼈 표면 내에 둘러싸여 표시됩니다.

다양한 관심 영역 또는 ROI를 식별하려면 손실 탐색기를 활성화하고 나선형 모드를 사용하여 개요를 생성합니다. 단일 이미지 아이콘을 클릭하여 선택한 ROI 위치를 기록하고 작업 목록에서 각 위치의 이름을 바꿉니다. Z 스택 볼륨을 획득하려면 Z 스택 모드를 선택하고 3마이크로미터에서 스텝 크기를 정의합니다.

모든 영역에 대해 동일한 스택 크기 옵션을 선택 취소한 다음 시작을 눌러 시작하고 끝을 눌러 완료합니다. 캡처 후 스택 재정의를 클릭합니다. 시작을 눌러 이미지 수집을 시작하고 이미지를 해당 폴더에 저장합니다.

혈관 투과성과 같은 동적 특징을 측정하려면 획득 모드를 XYZT로 변경하여 시간 경과를 획득합니다. T 모듈에서 시간 간격을 3분으로, 지속 시간을 1시간으로 조정합니다. 이제 100마이크로리터의 70킬로달톤 덱스트란 TRITC를 밀리리터당 4밀리그램의 농도로 정맥 주사하고 획득을 시작합니다.

마우스를 섭씨 37도 가열 패드의 수술 자국에 옮긴 후 두개골에 부위 내 젤을 도포하여 수분을 유지합니다. 특정 덮개로 머리 임플란트의 이미징 영역을 닫고 나사로 덮개를 조심스럽게 고정합니다. 마우스를 섭씨 37도로 설정된 가열 상자에 넣고 깨어날 때까지 기다립니다.

쥐가 완전히 회복되면 동물 시설로 옮겨 하이드로겔과 환경 강화가 있는 깨끗한 케이지에 보관합니다. 세로 획득의 경우 헤드 홀더가 이미 설치된 마우스의 눈에 안과용 젤을 소량 떨어뜨립니다. 앞에서 설명한 대로 개요 이미지를 가져옵니다.

필요한 경우 로드 및 정렬 이미지 모듈을 사용하여 이전 이미지와 새 이미지를 다시 정렬합니다. 화면 캡처 이미지를 열어 원래 위치의 위치를 표시합니다. 티타늄 머리 고정 임플란트의 CAD 모델은 두개골의 해부학적 구조에 부합하도록 설계되어 세포 수준 이미징을 위해 현미경 단계에 안정적으로 부착됩니다.

임플란트는 마우스 두개골에 성공적으로 부착되어 시간이 지남에 따라 안정적인 이미징을 가능하게 하는 동시에 마우스가 정상적인 활동을 유지할 수 있도록 했습니다. 두개골 골수 맥관 구조는 타일 스캔을 사용하여 시각화되어 세동맥, 전이 모세혈관 및 정현파의 복잡한 네트워크를 드러냈습니다. 정량적 혈관 분석은 혈관 구조의 분할을 입증하여 혈관 직경, 길이, 직진도 및 이들의 상관 관계를 측정할 수 있게 했습니다.

종단 영상은 시간이 지남에 따라 증가된 혈관 밀도가 관찰되는 백혈병 진행 동안 두개골 맥관 구조의 점진적인 리모델링을 포착했습니다. 혈관 투과성을 동적으로 평가하여 시간 경과에 따른 형광 염료의 차등 보유를 보여주고 다양한 골수 혈관의 차등 투과성을 나타냈습니다.