다운스트림 응용을 위한 조류 배란 전 여포 granulosa 및 Theca 세포층 분리

우리는 Langhand 난소의 특화된 과립층과 테카 세포를 이해하려고 합니다. 우리는 배란 중 서로 다른 지점에서 두 세포 유형 간의 차등 유전자 발현을 연구합니다. 이는 난자 생산을 지속 가능하게 향상시키는 데 사용될 번식 효율성과 생식력에 대한 통찰력을 제공합니다.

가금류 생식 생물학은 현재 차세대 염기서열분석 기술과 대사 분석을 사용하여 연구되고 있습니다. 이것은 생식 조직과 성적 성숙 및 배란과 관련된 호르몬 상호 작용을 모두 연구하기 위해 수행됩니다. Granulosa 세포층이 항상 온전한 시트로 분리되는 것은 아닙니다.

실제로 환자는 더 높은 성공 확률을 보장해야 합니다. 과립층 층에 남아 있는 여분의 노른자는 또 다른 우려 사항입니다. 차가운 PBS에서 배양 시간이 길면 이 문제를 완화할 수 있습니다.

그렇지 않으면 다운스트림 정리가 필요할 수 있습니다. 이 기술은 조류 생식 생물학자들 사이에서 표준화를 가능하게 할 것입니다. 염기서열분석 기술이 향상됨에 따라 장기 내 특수 세포의 역할을 규명하는 것이 점점 더 쉬워지고 있습니다.

따라서 특수 세포 유형을 분리하는 기술의 시각화는 향후 복제에 매우 중요합니다. 시작하려면 성적으로 성숙한 암컷 새에서 분리된 난포를 가져다가 얼음 위에 놓습니다. 조작하기 전에 모낭을 연구하고 줄기의 위치, 암술머리 및 생식 디스크를 기록하십시오.

그런 다음 마른 종이 타월 위에 모낭을 부드럽게 굴리고 필요한 경우 여포 표면에서 장막을 떼어냅니다. PBS로 채워진 그릇 위에 줄기를 잡고 중력을 사용하여 모낭 표면에서 줄기가 끝나는 위치를 시각화합니다. 가위를 사용하여 난포 표면에 구멍을 뚫지 않고 줄기만 자르고 더 이상 보이지 않을 때까지 장막을 계속 제거합니다.

라이트 박스를 사용하여 조명을 비추고 생식 디스크를 참조로 사용하여 암술을 반대쪽으로 재배치합니다. 암술머리 면이 보이도록 난포를 부드럽게 잡고 얼음처럼 차가운 PBS 그릇 바로 위에 모낭을 놓습니다. 그런 다음 메스를 집어 암술머리의 길이를 따라 부드럽게 자릅니다.

난황이 빠지기 시작하면 즉시 난포를 PBS에 떨어뜨립니다. 톱니가 없는 곧은 조직 집게를 사용하여 슬라이스의 한쪽 면에 있는 노른자에서 난포 벽의 분홍색 층을 부드럽게 벗겨냅니다. 작은 꼬집음과 당기는 동작을 계속하여 난포 벽을 난황에서 들어 올립니다.

층 분리를 수행하려면 한 번에 약 5mm의 여포 벽 조직을 난황에서 멀리 후퇴시킵니다. 5mm 부분이 접히면 각진 집게를 직선 집게와 나란히 사용하여 모낭 껍질을 따라 탐색합니다. 과립층 층이 발견되면 단단히 Theca 층에 집어 넣고 앞에서 설명한 대로 두 층을 모두 노른자에서 계속 당겨 빼냅니다.

그런 다음 구부러진 집게를 사용하여 꼬집은 층에서 노른자를 가볍게 털어냅니다. 찢어지지 않도록 과립층 층을 긁어내지 않고 그릇에서 과도한 노른자를 쓸어내거나 제거하십시오. 여포 벽의 각 5-10mm 부분을 후퇴시킨 후 잠시 멈추고 집게를 사용하여 테카 층과 과립층 층을 서로 벗겨내고 난황에서 제거합니다.

이제 곧은 집게를 사용하여 생식 디스크에 조심스럽게 접근하십시오. 과립층 층을 Theca 층에 단단히 고정합니다. 구부러진 집게를 사용하여 가벼운 칫솔질 동작을 사용하여 생식 디스크를 과립층 세포에서 난황 표면으로 밀어냅니다.

생식 디스크가 연구 표본으로 필요한 경우 각진 집게를 사용하여 노른자를 털어냅니다. 구부러진 집게로 난포벽에서 난황을 계속 분리하여 난포의 전체 영역에 난황이 없어질 때까지 계속합니다. 나머지 노른자를 털어낸 후 과립층의 마지막 부분을 테카 층에서 분리합니다.

완전히 분리된 과립층 층이 멍에 물질로 심하게 코팅되지 않고 가능한 한 깨끗한지 확인하십시오. granulosa 층과 theca 층을 섭씨 4도 PBS의 별도 용기에 넣습니다. 과립층과 테카층을 지정된 용기에 넣은 후 PBS의 테카층을 집게로 부드럽게 교반하여 과립층의 잔여물을 분리합니다.