C-배당체-절단 장내 세균의 스크리닝 및 분리

우리의 연구 범위는 의학을 위한 마이크로 바이러스 테스트입니다. 우리는 장내 세균의 스크리닝 및 격리를 위한 효과적인 SOP를 확립하기 위해 노력하고 있습니다. 현재까지 글리신 기능을 가진 총 18개의 박테리아 균주가 발견되었습니다.

우리 프로토콜의 장점은 박테리아 활동을 유도하기 위해 저탄소 소스 매체를 사용하여 스크리닝 성공률을 높일 수 있다는 것입니다. 시작하려면 적절한 시약을 사용하여 용액 A, B 및 C를 개별적으로 준비합니다. 1, 000 밀리리터 삼각 플라스크에 있는 모든 3개의 해결책을 섞고, 1, 000 밀리리터의 마지막 양을 구성하기 위하여 증류수를 추가하십시오.

그런 다음 10% 수산화나트륨 용액을 사용하여 pH를 7.2로 조정합니다. 매체를 250ml 삼각 플라스크에 분배합니다. 다음으로, 250 밀리리터 삼각 플라스크 중 하나에 일반 혐기성 매체에 2 % 오거를 추가합니다.

섭씨 121도에서 30분 동안 매체를 오토클레이브합니다. 매체가 실온으로 냉각된 후 섭씨 4도에서 보관하십시오. 저탄소 소스 매체를 유사하게 준비하되 효모 추출물, 포도당 및 수용성 전분은 생략합니다.

참조 용액의 경우 무게는 각각 orientin과 luteolin인 5mg입니다. 1 밀리리터의 디메틸 설폭 사이드에 별도로 용해시켜 밀리리터당 5 밀리그램의 농도를 얻습니다. 시작하려면 절차에 필요한 모든 배지와 시약을 준비합니다.

질소 가스로 채워진 일회용 멸균 대변 수집 튜브에 1-2g의 신선한 인간 배설물을 수집합니다. 튜브에 5ml의 일반 혐기성 매체를 추가합니다. 튜브를 철저히 밀봉하고 멸균 혐기성 인큐베이터에서 섭씨 37도에서 24시간 동안 배양합니다.

24시간 후, 0.5ml의 인간 장내 박테리아 현탁액을 4.5ml의 새로운 GAM이 들어 있는 새로운 마이크로 원심분리기 튜브로 옮깁니다. 튜브를 밀봉하고 혐기성 조건에서 섭씨 37도에서 24시간 동안 배양하여 활성 혼합 인간 장내 세균총을 얻습니다. 다음으로, 260마이크로리터의 활성 장내 세균총을 40마이크로리터의 배향 기준 용액을 함유하는 6밀리리터의 새로운 저탄소 소스 배지와 혼합했습니다.

접종된 배지를 섭씨 37도에서 배양합니다. 샘플 외에 컨트롤과 빈 그룹을 포함합니다. 24시간 및 48시간 후, 반응 용액 1ml를 1.5ml 마이크로 원심분리기 튜브에 피펫으로 넣습니다.

튜브를 13, 400G에서 실온에서 15분 동안 원심분리하여 박테리아를 제거합니다. 600 마이크로리터의 메탄올에 200 마이크로리터의 상등액을 첨가합니다. 잘 섞은 다음 튜브를 13, 400G에서 실온에서 15분 동안 원심분리하여 단백질을 제거합니다.

이제 0.22 마이크로미터 미세 다공성 멤브레인을 사용하여 상층액을 여과합니다. 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)를 통해 여과액을 분석합니다. 아세톤 니트롤을 이동상 A로 사용하고 정제수에 0.1% 포름산을 이동상 B로 사용합니다.HPLC 분석 중 섭씨 40도의 온도를 유지하고 유속을 분당 1밀리리터로 설정합니다.

단일 균주를 분리하려면 앞서 설명한 대로 오리엔틴을 절단할 수 있는 혼합된 인간 장내 세균총을 활성화하십시오. 고체 GAM을 가열하여 용해시키고 혐기성 인큐베이터 내부의 일회용 멸균 페트리 접시에 붓습니다. 매체가 응고되어 단단한 GAM 플레이트를 얻을 수 있도록 합니다.

100마이크로리터의 활성 박테리아 용액을 1.5밀리리터의 생리식염수가 들어 있는 1.5밀리리터 마이크로 원심분리 튜브에 피펫팅합니다. 일회용 접종 링을 사용하여 적절한 양의 박테리아 용액을 페트리 접시에 접종합니다. 접시를 밀봉하고 섭씨 37도의 혐기성 인큐베이터에서 배양합니다.

48 시간의 배양 후 플레이트에있는 식민지의 크기, 형태 및 색상을 관찰하십시오. 뚜렷한 단일 박테리아 콜로니를 선택하고 4.5ml의 신선한 GAM을 함유한 10ml 마이크로 원심분리 튜브에서 배양합니다. 섭씨 37도의 혐기성 조건에서 24시간 동안 배양하여 단일 균주를 얻습니다.

앞서 설명한 대로 단일 균주의 활성을 확인하고 HPLC를 사용하여 활성 검증을 수행합니다. 10개 중 1개의 대변 샘플은 형질전환 실험 중에 오리엔틴을 탈글리코실레이트하는 능력을 입증하여 활성 샘플에 대한 스크리닝의 타당성을 확인했습니다.