쥐 심혈관 리모델링에 대한 다중 모드 연구: 4차원 초음파 및 질량 분석 이미징

저희 연구실에서는 전임상 초음파 영상을 사용하여 다양한 질병 및 생리학적 상태의 심혈관 생체 역학을 연구합니다. 또한 질량 분석 이미징을 사용하여 심혈관 및 뇌 조직에서 지질의 공간적 분포를 연구합니다. 우리는 조직의 어느 부위에서 기능적, 분자적 변화가 일어나는지 보려고 노력하고 있습니다.

조직학 및 면역조직화학과 같은 일반적인 분자 이미징 기술로 분자 데이터를 얻을 수 있지만 현재 사용 가능한 염색 및 항체에 의해 제한됩니다. 반면에, 질량 분석 이미징은 조직의 공간적 무결성을 여전히 유지하는 다중체학 연구를 위한 비표적 접근 방식입니다. 우리의 기술을 통해 지질, 글라이칸 및 펩타이드를 포함하도록 다중오믹스를 확장하고 이를 초음파와 같은 기능적 이미징 기술과 결합할 수 있습니다.

이러한 기술을 통해 연구원들은 이제 기능적 이미징과 분자 이미징 기술을 결합할 수 있습니다. 저희 연구실에서는 심혈관 질환에 대한 두 가지 주요 중점 분야를 연구하고 있는데, 그 중 하나는 심장 마비나 암 치료를 통한 심장 리모델링, 즉 심장 독성을 연구하는 것입니다. 두 번째 큰 심혈관 목표는 노화와 노화가 혈관 조직에 어떤 영향을 미치는지 살펴보는 것입니다.

심장 4차원 초음파를 수행하려면 마우스를 이미징 플레이트의 앙와위 위치에 놓습니다. 그런 다음 변환기를 홀더의 반 잠금 위치에 놓습니다. 변환기의 돌출된 점을 화면의 파란색 점에 정렬하여 마우스의 오른쪽을 향하도록 배치합니다.

변환기를 돌려 마우스의 시상면을 따라 올려진 노치가 꼬리를 가리키도록 정렬합니다. 변환기와의 음향 결합을 위해 흉강의 복부 표면에 충분한 양의 초음파 젤을 바르십시오. 초음파 젤에 닿을 때까지 변환기를 내립니다.

미세 조정을 위해 플레이트 바닥에 있는 XY 손잡이로 정밀하게 조정합니다. 다음으로, 화면의 흉골 주위 장축 보기에 정확한 이미징을 위해 수평으로 정렬된 정점, 좌심실 유출로 및 대동맥이 포함되는지 확인합니다. 화면 아래쪽 모서리에서 이미지 이름 지정을 선택하여 이미지를 현재 시리즈에 저장합니다.

변환기를 시계 방향으로 90도 회전하여 흉골 주변 단축 view. 좌심실이 이미지에 명확하게 정의되어 있고 유두 근육이 보이는지 확인합니다. 화면의 왼쪽 상단 모서리에 있는 큐브 아이콘을 선택하여 4차원 이미지를 설정합니다.

변환기를 재설정한 후 시작 위치를 정점 바로 아래로, 정지 위치를 대동맥궁으로 조정합니다. 단계 크기를 0.08 - 0.13mm로 설정하고 프레임 속도를 200 - 300헤르츠로 설정합니다. 스캔을 시작하기 전에 활력 징후와 EKG 신호가 안정적으로 유지되는지 확인하십시오.

스캔 및 처리를 완료한 후 후처리를 위해 EKV/4D 데이터 저장 및 호흡 게이팅을 켭니다. 오른쪽 아래 모서리에서 이름 이미지를 선택하고 이름에 마우스 ID를 포함합니다. 심장 주기를 통해 각 시야 평면을 시각화하려면 More Controls(추가 컨트롤)를 선택하고 Load Into Four-Dimensional(4차원으로 로드)을 선택합니다.

심장의 각 평면도를 검토하여 심장 주기 전반에 걸쳐 심장의 중심이 안정적으로 유지되는지 확인합니다. 시작하려면 마우스 조직의 급속 냉동을 위해 알루미늄 호일 보트를 준비하십시오. 집게를 사용하여 안락사된 쥐의 피부를 텐트로 덮고 혈관 접근을 위해 목 위에 가위로 텐트를 치거나 심장 접근을 위해 흉골 바로 아래를 잘라냅니다.

피부와 근육층을 계속 절단하여 혈관 조직을 노출시킵니다. 심장 제거의 경우 뼈를 잘라 심장을 노출시킵니다. 면봉으로 둔기를 해부하여 심장이나 혈관 구조를 지방을 포함한 주변 조직으로부터 분리하십시오.

경동맥 혈관과 신경을 조심스럽게 분리하십시오. 그런 다음 수술 도구를 사용하여 심장이나 혈관 구조를 제거합니다. 경동맥 혈관, 심장 및 혈관 구조를 미리 라벨링된 알루미늄 호일 보트에 놓습니다.

그런 다음 급속 냉동을 위해 보트를 액체 질소에 넣습니다. 먼저 비커에 HPLC 물을 채우고 5ml 및 1ml 주사기와 함께 따로 보관합니다. 그런 다음 저온 유지 온도를 섭씨 영하 25도로 설정하고 블레이드를 삽입합니다.

조직을 장착하기 전에 저온 유지 장치 챔버 내부에 집게 한 쌍을 놓아 식히십시오. 5ml의 HPLC 물을 주사기에 넣고 저온 유지 장치에 넣어 물을 부분적으로 동결시킵니다. 주사기의 물이 완전히 얼기 전에 금속 척에 물을 분배하고 완전히 얼도록 합니다.

이제 1ml 주사기에 HPLC 물을 채우고 저온 유지 장치에 넣습니다. 30-60초 후 척 중앙에 부분적으로 응고된 물을 소량 놓습니다. 집게를 사용하여 추출한 쥐 심장을 물방울에 빠르게 넣고 주변 물이 완전히 얼 때까지 그대로 유지합니다.

시작하려면 냉동실에서 마우스 심장이 장착된 슬라이드를 제거하고 건조기에 넣어 건조시킵니다. HTX M3+분무기를 켭니다. 노트북에서 HTX 앱을 열고 방법에서 노즐 온도를 섭씨 75도, 유속을 분당 100마이크로리터, 압력을 10psi로 설정합니다.

시료 이름, 극성, 매트릭스, 용매 및 농도를 실험실 노트에 기록하십시오. 그런 다음 원하는 농도에 필요한 매트릭스 양을 계산합니다. 다음으로, 포지티브 모드 매트릭스에 대해 원하는 양의 2, 5-디하이드록시벤조산의 무게를 잰다.

매트릭스를 15 밀리리터 튜브에 70 % 메탄올에 용해시킵니다. 매트릭스 용액을 10분 동안 초음파 처리합니다. 초음파 처리 중에 데시케이터에서 슬라이드를 제거합니다.

분무기 트레이를 엽니다. 그런 다음 슬라이드를 왼쪽 하단 모서리에 놓고 가장자리를 테이프로 붙입니다. 샘플 스프레이 영역을 선택하고 트레이를 닫습니다.

주사기와 필터를 사용하여 매트릭스 용액을 주사기로 끌어들입니다. 주사기를 통해 매트릭스 용액을 분무기 왼쪽에 있는 검은색 뚜껑이 있는 바이알로 여과합니다. 바이알을 분무기의 지정된 위치에 다시 놓고 D 라인 튜브를 바이알에 단단히 삽입합니다.

그런 다음 불활성 가스를 켜고 분무기의 게이지가 10psi를 가리키는지 확인합니다. 시작을 누르고 분무기가 설정 온도에 도달하면 깜박이는 시작 버튼을 선택하여 분무를 시작합니다. 스프레이가 완료되면 분무기에서 샘플을 제거하고 MALDI 슬라이드 홀더에 넣습니다.

스캐너를 사용하여 MALDI 슬라이드 홀더와 슬라이드를 스캔합니다. 질량 분석 이미징에 사용할 수 있도록 플래시 드라이브에 이미지를 저장합니다. 분무기에서 세척 옵션을 선택하고 매트릭스 바이알에서 폐기물 비커로 D 라인을 이동합니다.

마지막으로 분무기 트레이에 메탄올을 뿌리고 깨끗이 닦습니다. 질소를 끕니다. 경색된 심근 조직의 MALDI 질량 분석 영상은 분자 이온 질량이 577.52를 충전하는 것을 확인했으며, 이는 C 또는 D의 COHb에 해당할 가능성이 높으며, 이는 심근 리모델링에 관여함을 시사합니다.

4차원 초음파 이미지는 표면적이 변형된 크기가 20% 미만인 심근 영역을 보여주었으며, 경색 영역을 나타내는 녹색-노란색 조직으로 시각화되었습니다. 심근경색 조직의 장축 보기에서 지질 비편재화가 보였으며, 이는 조직 생체 역학과 분자 구성 간의 상관관계를 복잡하게 만들었습니다.