In vitro Ubiquitin Chain Cleavage Assay를 통한 신경 발달 장애 관련 Deubiquitylating Enzymes의 효소 활성 측정

우리는 유비퀴틴 시스템의 효소에서 유전자 변이와 관련된 신경 발달 장애의 분자적 기초를 정의하는 데 관심이 있습니다. 우리는 최첨단 기술을 사용하여 이러한 효소에 의해 제어되는 신호 전달 경로를 해부하고 유전자 변이가 단백질 생물학에 미치는 영향을 결정합니다. 이 방법의 장점은 특정 DUB에 의해 조절되는 기판에 대한 사전 지식이 필요하지 않은 기판 독립적 기술이라는 것입니다.

이러한 방식으로 DUB 촉매 활성에 대한 신경 발달 장애 관련 유전자 변이의 영향을 직접 측정하고 가능한 병원성 메커니즘을 제안할 수 있습니다. 대부분의 DUB의 세포 기능은 잘 알려져 있지 않기 때문에 우리 연구실에서는 이러한 효소가 매개하는 신호 전달 경로를 식별하고 유전 질환과 관련된 유전자 변이가 이러한 과정에 어떻게 영향을 미치는지 확인하는 데 중점을 둘 것입니다. 먼저, 화학적으로 효과가 있는 Rosetta 2 Escherichia coli 세포 20마이크로리터를 사용 직전에 얼음에서 해동하십시오.

pGEX6P1 USP27X 발현 플라스미드를 1-10나노그램에 넣고 얼음 위에서 5분간 배양합니다. 건욕에서 섭씨 42도에서 30초 동안 세포에 열 충격을 가합니다. 그런 다음 세포를 얼음 위에서 2분 동안 배양합니다.

80마이크로리터의 실온 SOC 매체를 셀에 추가합니다. 섭씨 37도에서 200RPM 회전으로 19mm 궤도의 벤치탑 온도 조절 쉐이커에서 60분 동안 배양합니다. 그런 다음 클로람페니콜과 암피실린을 보충한 LB 한천 플레이트에 배양액 50마이크로리터를 플레이트에 담습니다.

섭씨 37도에서 뚜껑이 아래로 향하게 하여 온도 조절이 가능한 인큐베이터에서 20시간 동안 배양합니다. 형질전환된 박테리아의 단일 군집을 선택하여 클로람페니콜과 암피실린이 보충된 10ml의 멸균 LB 배지에 첨가합니다. 앞서 보여진 것처럼 20시간 동안 배양합니다.

그런 다음 클로람페니콜과 암피실린이 보충된 TB 배지 1리터에 하룻밤 배양액 10ml를 추가합니다. 600 나노미터의 광학 밀도가 0.5 - 0.6에 도달할 때까지 배양합니다. 다음으로, 50마이크로몰 이소프로필 베타-d-1-티오갈락토피라노사이드를 배양액에 첨가하여 발현을 유도합니다.

샘플을 섭씨 16도로 냉각한 후 섭씨 16도에서 200RPM 회전으로 20시간 동안 배양합니다. 그런 다음 섭씨 4도에서 3000G 이상에서 20분 동안 세포를 원심분리하여 발현 배양에서 세포를 펠렛화합니다. 마지막으로 펠릿을 섭씨 영하 80도에서 최소 1시간 동안 보관합니다.

시작하려면 빈 중력 흐름 컬럼을 레토르트 스탠드에 고정합니다. 2-3 밀리리터의 글루타티온 아가로스 수지로 컬럼을 채워 1리터의 발현 배양물에서 수집된 세포 펠릿을 정제합니다. 20% 에탄올의 수지 베드 부피 1개로 컬럼을 세척합니다.

컬럼을 세척한 후 세포 펠릿을 섭씨 4도에서 해동합니다. 해동된 펠릿에 30ml의 MS500 완충액을 넣고 부드럽게 회전시키면서 배양합니다. 이제 피펫 팁에서 분주할 때 용해물이 자유롭게 흐를 때까지 얼음 위에서 50밀리리터 원심분리기 튜브에서 용해된 세포를 초음파 처리합니다.

4개의 섭씨 온도에 30 분 동안 분리기 및 20 의 000 G 또는 더 높은 것은 상층액을 맑게 하기 위하여. 그런 다음 상층액을 디캔팅하여 비커에 넣고 투명화된 용해물을 컬럼에 로드합니다. flow-through를 수집하면서 중력 흐름에 의해 컬럼을 통해 용해물을 실행합니다.

그런 다음 MS500 세척 완충액을 최소 2회 용량의 레진 베드로 컬럼을 세척하고 세척 플로우스루를 5ml로 수집합니다. 다음으로, 각 분획의 1마이크로리터를 100마이크로리터의 Bradford 시약에 첨가하여 단백질의 존재를 확인합니다. MS500 elusion buffer를 컬럼을 통해 실행하고 5mL의 용리 분획을 수집하여 단백질을 회수합니다.

단백질을 침전시키려면 용리액에 2부피의 4몰 황산암모늄을 넣고 튜브가 뿌옇게 될 때까지 튜브를 부드럽게 뒤집습니다. 4개의 섭씨 온도와 20, 000 G 또는 더 높은 것에 30 분 동안 분리기. 각 원심분리 후 단백질 펠릿을 방해하지 않고 상층액을 제거하십시오.

그런 다음 단백질을 저장하기 전에 25% 글리세롤이 보충된 MS500 완충액에 다시 용해시킵니다. 각 탈유비퀴틸화 효소에 대한 각 시점에 대해 탈유비퀴틸화 효소 활성화 완충액에 정제된 GST 태그가 부착된 USP27X 10마이크로리터를 준비합니다. 유비퀴틴 사슬을 추가하기 전에 7마이크로리터의 SDS-PAGE 로딩 버퍼를 타임 제로 샘플에 추가하여 탈유비퀴틸화 반응이 시작되는 것을 방지합니다.

각 deubiquitylating 효소에 대한 각 시점에 10 마이크로 리터의 효소 활성화 완충액에 희석 된 375 나노그램의 K63 결합 디 유비퀴틴 사슬을 추가합니다. 섭씨 30도에서 튜브를 배양하고 7마이크로리터의 SDS-PAGE 로딩 버퍼를 추가하여 각 시점을 중지합니다. 4-12% 그래디언트 겔을 사용하여 SDS-PAGE를 수행합니다.

야생형 USP27X는 1시간의 배양 후 K63 결합 디-유비퀴틴 사슬을 모노-유비퀴틴으로 절단했습니다. XLID-105 관련 분산 F313V, Y381H 및 S404N은 배양 1시간 후에도 K63 연결 디-유비퀴틴 사슬을 절단하지 않았습니다.