일과성 국소 허혈과 결합된 급성 고혈당증에 의해 유도된 출혈성 변형의 마우스 모델

본 연구에서는 급성 고혈당증이 있는 C57BL/6 마우스에서 중대뇌동맥 폐색 재관류를 이용한 인간 급진적 형질전환의 재현성이 높은 동물 모델을 구축하기 위한 포괄적이고 상세한 프로토콜을 제공하는 것을 목표로 합니다.

다른 기술과 비교하여 당사의 프로토콜은 우수한 반복성, 높은 안정성 및 낮은 동물 사망률을 보여주므로 출혈성 형질전환의 전임상 연구에 널리 사용하기에 적합합니다.

앞으로 우리는 출혈성 변형이 신경학적으로 미치는 영향을 조사하고 기본 메커니즘을 탐구하는 데 중점을 둘 것입니다.

[강사] 시작하려면 수술 플랫폼과 주변 작업 영역을 75% 에탄올로 닦습니다. 난방 스위치를 켜고 온도를 섭씨 37도로 설정합니다. 마취된 마우스를 누운 자세로 수술 플랫폼 위로 옮기고 접착 테이프를 사용하여 팔다리를 고정합니다. 그런 다음 수술 15분 전에 30% 포도당 또는 생리 식염수를 마우스에게 복강 내 투여합니다. 메스를 사용하여 목의 정중선을 따라 1.5cm의 구멍이 있는 수평 절개를 합니다. 좌측 총경동맥을 식별하고 분리하기 위해 역삼각형 영역 내에서 둔기 해부를 수행합니다. 안과 겸자를 사용하여 총경동맥에 인접한 미주 신경과 혈관을 둘러싼 점막 조직을 해부합니다. 5-0 폴리글리콜산 흡수성 봉합사를 사용하여 총경동맥에 링거를 만들어 봉합사에 긴장을 풀지 않은 상태로 유지합니다. 그런 다음 총경동맥을 따라 위쪽으로 분리합니다. 이제 분기점을 분리하여 외경동맥과 내경동맥을 완전히 노출시킵니다. 분기점에서 원위쪽으로 외경동맥 주위에 5-0 폴리글리콜산 흡수성 봉합사를 고리로 묶고 단단히 묶습니다. 다음으로, 두 개의 가벼운 마이크로 세라파인 동맥 클램프를 사용하여 총경동맥과 내경동맥을 모두 일시적으로 고정하여 혈류를 차단합니다. 그런 다음 외경동맥 원위부와 총경동맥의 봉합사를 늘려 외경동맥 분절을 곧게 펴줍니다. 이제 마이크로 가위를 사용하여 외경동맥의 두 봉합사 타이 사이에 작은 절개를 합니다. 30mm 길이의 실리콘 코팅 모노필라멘트 봉합사를 외경동맥에 삽입합니다. 모노필라멘트 봉합사가 빠지는 것을 방지하기 위해 분기점 근처의 외경동맥에 두 번째 5-0 폴리글리콜산 흡수성 봉합사를 고리로 묶고 약간 묶습니다. 그런 다음 영구 결찰 원위부의 외경동맥을 완전히 절단하고 내경동맥에서 동맥 겸자 클램프를 제거합니다. 다음으로 총경동맥의 분기점까지 봉합사를 빼냅니다. 외경동맥 그루터기를 조심스럽게 후퇴시키고 회전시킵니다. 봉합 방향을 조정하고 총경동맥 분기점에서 내경동맥으로 9-10mm 떨어진 곳에 삽입하여 중대뇌동맥을 막습니다. 그런 다음 외경동맥 주위에 두 번째 폴리글리콜산 흡수성 봉합사를 조이고 총경동맥에서 동맥 클램프를 제거합니다. 마우스를 재마취한 후 마이크로클립 동맥 클램프를 사용하여 총경동맥을 고정합니다. 실리콘으로 코팅된 팁이 내경동맥을 통해 보일 때까지 내경동맥에서 모노필라멘트를 부분적으로 후퇴시킵니다. 그런 다음 실리콘 코팅 팁 위의 내경동맥에 또 다른 마이크로클립 동맥 클램프를 놓습니다. 모노필라멘트를 완전히 빼내고 외경동맥 그루터기를 단단히 고정합니다. 마지막으로 내경동맥과 총경동맥에서 각각 마이크로클립 동맥 클램프를 제거합니다. 시작하려면 알코올에 적신 면봉으로 쥐의 꼬리를 닦아 꼬리 정맥이 완전히 충혈되도록 합니다. 수술용 가위를 사용하여 꼬리 끝을 1-2mm 잘라냅니다. 꼬리 뿌리를 따라 끝까지 부드럽게 짜서 절개 부위에서 혈액이 흐르도록 합니다. 그런 다음 시험지의 샘플 흡수 탱크를 혈울 가장자리에 배치합니다. 혈당 측정기 판독값을 읽고 결과를 기록하십시오. 뇌혈류 측정의 경우 안정적인 플럭스가 읽힐 때까지 레이저 도플러 유량 측정 프로브 팁을 왼쪽 두정엽 두개골 표면에 수직으로 잡고 이 값을 기록합니다. 안락사된 MCAO 마우스의 뇌를 제거한 후 설치류 뇌 기질에 뇌 조직을 넣고 2mm 관상 조각으로 자릅니다. 슬라이스를 24웰 플레이트로 옮기고 섭씨 37도에서 2% 2,3,5-트리페닐테트라졸륨 염화물 용액과 함께 15분 동안 배양합니다. 그런 다음 곡선 겸자로 24웰 플레이트에서 조직 절편을 잘라내고 유리 스캐닝 플레이트에 배열합니다. 고정된 뇌 절편을 헤마트실린 용액으로 3분 동안 염색합니다. 슬라이스를 5% 염산 알코올에 5초 동안 담가 구별합니다. 그런 다음 그래디언트 에탄올 용액과 자일렌을 사용하여 슬라이스를 탈수하고 히알린화합니다. 중성 수지로 섹션을 장착합니다. MCAO 후 23시간 후 2% Evans Blue 용액을 마우스에 주입하고 뇌를 채취합니다. 조직을 균질화하고 원심분리한 후 상청액을 다른 원심분리 튜브로 옮기고 에탄올로 4배 희석합니다. 분광 광도계를 사용하여 620나노미터에서 상층액의 흡광도를 측정합니다. MCAO 후 24시간 후에 FITC-덱스트란을 꼬리 정맥에 주입하고 10분 동안 혈액 중을 순환시킵니다. 뇌 조직을 고정한 후 최적의 절단 온도 컴파운드를 사용하여 뇌 조직을 매립하고 30마이크로미터 두께의 절편으로 절단합니다. 접종 루프를 사용하여 절편을 현미경 슬라이드로 옮겨 슬라이드 표면에 부착되도록 합니다. 4',6-디아미디노-2-페닐인돌을 함유한 마운팅 매체를 사용하여 뇌 조직 절편을 마운트합니다. 혈당 수치는 식염수 그룹에 비해 포도당을 주사한 마우스에서 MCAO 후 유의하게 증가했습니다. 식염수를 사용한 가짜 또는 포도당을 사용한 가짜 그룹의 뇌 절편에서 눈에 보이는 경색이 관찰되지 않았습니다. 포도당이 포함된 MCAO 그룹은 식염수가 포함된 MCAO 그룹에 비해 유의하게 더 큰 뇌경색 부피를 보였습니다. 포도당 그룹과 함께 MCAO의 허혈성 반구에서 다발성 점상 출혈이 관찰되었는데, 이는 다른 그룹에는 없었습니다. 포도당 그룹이 있는 MCAO의 피질과 선조체의 경색 영역에서 상당한 혈구 침윤이 관찰되었습니다. Evans Blue 투과성과 FITC-덱스트란 누출은 식염수를 사용한 MCAO 그룹에 비해 포도당이 있는 MCAO 그룹에서 현저하게 더 높았습니다.