Name: 대식세포-종양 스페로이드 동시 침습 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-01-24T13:50:00.000+00:00
Duration: 9 min 1 s
Description: 배우세요 대식세포와 종양 스페로이드의 3D 콜라겐 I 매트릭스 내 동시 침습 분석 방법을. KIF16B 결핍 대식세포가 암세포 침습을 감소시키는 역할을 확인하고, 거세포 표면 단백질 재활용이 종양 미세환경에 미치는 영향을 연구합니다.

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<meta charset="utf8"></head><body>3D 콜라겐 매트릭스 설정에서 대식세포-종양 스페로이드 상호 작용 검사

<ol><li>Lendeckel, U., Venz, S., Wolke, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophages%3A+shapes+and+functions%5BTitle%5D)+AND+%22ChemTexts%22%5BJournal%5D)">Macrophages: shapes and functions.</a> ChemTexts. 8 (2), 12(2022).</li>
<li>Dallavalasa, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+tumor+associated+macrophages+%28TAMs%29+in+cancer+progression%2C+chemoresistance%2C+angiogenesis+and+metastasis+-+Current+status%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">The role of tumor associated macrophages (TAMs) in cancer progression, chemoresistance, angiogenesis and metastasis - Current status.</a> Curr Med Chem. 28 (39), 8203-8236 (2021).</li>
<li>Pan, Y., Yu, Y., Wang, X., Zhang, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor-associated+macrophages+in+tumor+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Tumor-associated macrophages in tumor immunity.</a> Front Immunol. 11, 583084(2020).</li>
<li>Boutilier, A. J., Elsawa, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+Polarization+States+in+the+Tumor+Microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Macrophage Polarization States in the Tumor Microenvironment.</a> Int J Mol Sci. 22 (13), 6995(2021).</li>
<li>Wenzel, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intercellular+transfer+of+cancer+cell+invasiveness+via+endosome-mediated+protease+shedding%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Intercellular transfer of cancer cell invasiveness via endosome-mediated protease shedding.</a> Nat Commun. 15 (1), 1277(2024).</li>
<li>Anfray, C., Ummarino, A., Calvo, A., Allavena, P., Torres Andon, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+analysis+of+tumor-associated+macrophages+in+the+tumor+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">In vivo analysis of tumor-associated macrophages in the tumor microenvironment.</a> Methods Mol Biol. 2614, 93-108 (2023).</li>
<li>Hey, S., Wiesner, C., Barcelona, B., Linder, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((KIF16B+drives+MT1-MMP+recycling+in+macrophages+and+promotes+co-invasion+of+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Life+Sci+Alliance%22%5BJournal%5D)">KIF16B drives MT1-MMP recycling in macrophages and promotes co-invasion of cancer cells.</a> Life Sci Alliance. 6 (11), e202302158(2023).</li>
<li>Wu, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasticity+of+cancer+cell+invasion%3A+Patterns+and+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Transl+Oncol%22%5BJournal%5D)">Plasticity of cancer cell invasion: Patterns and mechanisms.</a> Transl Oncol. 14 (1), 100899(2021).</li>
<li>Shi, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+insights+and+therapeutic+intervention+of+tumor+metastasis%3A+latest+developments+and+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Signal+Transduct+Target+Ther%22%5BJournal%5D)">Mechanism insights and therapeutic intervention of tumor metastasis: latest developments and perspectives.</a> Signal Transduct Target Ther. 9 (1), 192(2024).</li>
<li>Li, G. N., Livi, L. L., Gourd, C. M., Deweerd, E. S., Hoffman-Kim, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+and+morphological+changes+of+neuroblastoma+cells+in+response+to+three-dimensional+matrices%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng%22%5BJournal%5D)">Genomic and morphological changes of neuroblastoma cells in response to three-dimensional matrices.</a> Tissue Eng. 13 (5), 1035-1047 (2007).</li>
<li>Lin, Y. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+cancer+cell+invasion+and+T-cell+cytotoxicity+in+3D+culture%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Monitoring cancer cell invasion and T-cell cytotoxicity in 3D culture.</a> J Vis Exp. 160, e61392(2020).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>15 &마이크로;-슬라이드 혈관 신생&nbsp;</td><td>ibidi</td><td>81506</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Invitrogen</td><td>00-4555-56</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 568 Phalloidin&nbsp;</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A12380</td><td></td></tr><tr><td>CD14 MicroBeads</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-050-201</td><td></td></tr><tr><td>CO2 인큐베이터</td><td>바인더</td><td></td><td></td></tr><tr><td>콜라겐 I 랫 테일&nbsp;</td><td>코닝</td><td>354236</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>AppliChem</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM (1x) + GlutaMAX</td><td>Gibco</td><td>31966-021</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Anprotec</td><td>MS01Y71003</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Bio& 셀</td><td>FBS. S 0613</td><td></td></tr><tr><td>피지&nbsp;</td><td>NIH</td><td>ImageJ 2 버전: 2.3.0/1.53s</td><td></td></tr><tr><td>포름알데히드 37%&nbsp;</td><td>252549-500ml</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td></tr><tr><td>H1299-GFP 세포주</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>인간 혈청 알부민</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5843</td><td></td></tr><tr><td>Leica TCS SP8 X</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>l-glutamine&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>25030-024</td><td></td></tr><tr><td>림프구 분리 매체 (LSM) 1077</td><td>PromoCell</td><td>C-44010</td><td></td></tr><tr><td>MS 컬럼</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-201</td><td></td></tr><tr><td>비필수 아미노산&nbsp;</td><td>시그마-알드리치</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>펜 스트렙</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>81275-034</td><td></td></tr><tr><td>TC-Platte 96 웰, BIOFLOAT, R&nbsp;</td><td>SARSTEDT</td><td>83,39,25,400</td><td></td></tr><tr><td>VORTEX-GENE 2&nbsp;</td><td>과학 산업</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

대식세포-종양 스페로이드 동시 침습 분석

A Macrophage-Tumor Spheroid Co-Invasion Assay

그림 1은 콜라겐 I 매트릭스에서 각 배양 일수에 이미지화된 H1299-GFP 스페로이드를 보여줍니다. 0일에 촬영한 각각의 명시야 이미지도 스페로이드와 공동 배양된 주요 인간 대식세포를 보여줍니다. 실험 3일차에 기록된 대표 이미지를 처리 후 확대한 것이다. 분석할 수 있는 다양한 매개변수가 표시되며, 여기에는 침입 세포의 수, 집단 침입 부위 및 회전 타원체 둘레가 포함됩니다. 포함된 표는 이 이미지에서 얻은 결과를 보여줍니다. 감지된 신호의 수는 시각적 인상과 일치합니다. 중앙 스페로이드의 붕괴는 보이지 않으며, 이는 스페로이드 파편에서 유래한 세포가 아닌 실제 개별 암세포 침입을 나타냅니다. 이제 통계 분석을 통해 다양한 스페로이드 및 조건의 결과를 비교할 수 있습니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67374/67374fig01.jpg"> 
그림 1: 대표적인 결과. (상단 패널) 콜라겐 I 매트릭스에서 배양 0일, 1일, 2일, 3일에 이미지화된 H1299-GFP 스페로이드. (왼쪽 중간 패널) 공동 배양된 1차 인간 대식세포를 보여주는 스페로이드의 명시야 이미지. (오른쪽 중간 패널) 처리 후 3일차에 획득한 대표 이미지는 분석할 수 있는 다양한 매개변수를 보여줍니다(빨간색의 스페로이드 둘레, 더 나은 시각화를 위해 수동으로 추적). (하단 패널) 오른쪽 중간 패널의 이미지에서 얻은 결과입니다. 참고: 대식세포는 암세포 거동을 밝히기 위해 GFP 채널만 기록되었기 때문에 대식세포는 보이지 않습니다. 스케일 바: 100μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67374/67374fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

The interaction of immune and cancer cells and their respective impact on metastasis represents an important aspect of cancer research. So far, only a few ...

우리는 전이 중에 암과 면역 세포가 어떻게 상호 작용하는지 더 잘 이해하기 위해 암과 면역 세포의 상호 작용을 조사하고자 합니다. 대부분의 경우, 생체 내 모델은 면역 체계의 맥락에서 암세포의 3D 침입에 관한 연구 질문을 추구하는 일상적인 방법이며, 시스템의 고립된 구성 요소에 초점이 맞춰져 있습니다. 생체 내 상황의 복잡성을 모방하지만 현미경으로 특정 환경 특성을 보다 직접적으로 조작할 수 있는 세포 거동을 분석할 수 있는 방법입니다.우리는 변경되지 않은 암세포가 운동 단백질 KIF16B에 대해 고갈된 대식세포와 함께 배양될 때 3D 콜라겐 I 매트릭스의 침입을 감소시킨다는 것을 입증합니다. 이는 종양 미세환경에서 대식세포 표면 단백질의 KIF16B 주도 재활용의 역할을 가리킵니다. 우리는 대식세포 암세포 맥락의 인터페이스에서 기질 분해를 시각화할 수 있는 방식으로 방법을 지속적으로 개선하여 분해 및 접착 메커니즘을 더 잘 이해하고자 합니다.시작하려면 섭씨 37도에서 25제곱센티미터 세포 배양 플라스크에 암세포 배지를 넣고 80% 합류점에 도달할 때까지 5%의 이산화탄소를 배양합니다. DPBS로 세포를 한 번 세척하고 세포가 분리될 때까지 2-3분 동안 1ml의 트립신-EDTA를 첨가합니다. 2ml의 암세포 배지를 첨가하여 효소 반응을 중단합니다.다음으로, 분리된 세포 현탁액을 245G의 15ml 튜브에 넣고 5분 동안 원심분리합니다. 펠릿을 5ml의 DPBS로 세척하기 전에 트립신 용액이 포함된 상등액을 제거하십시오. 원심분리 후, 펠릿을 5ml의 암세포 배지에 다시 현탁시킵니다.Neubauer 챔버를 사용하여 세포를 계산합니다. 8, 000 세포를 25 마이크로 리터의 암 세포 배지의 최종 부피에서 96 웰 초저 접착 플레이트로 옮깁니다. 세포를 섭씨 37도, 이산화탄소 5%에서 3일 동안 배양합니다.3일 후 현미경으로 스페로이드의 균일성을 확인합니다. 인간 혈액 샘플을 채취한 후 수혈 백에서 20ml의 혈액을 50ml 반응 튜브로 옮깁니다. 15ml의 림프구 분리 배지를 새로운 50ml 튜브에 추가합니다.20ml의 혈액을 섞지 않고 림프구 분리 배지 함유 튜브에 조심스럽게 옮기고 혼합물을 450G에서 섭씨 4도에서 30분 동안 원심분리합니다. 원심분리 중에 10ml의 차가운 RPMI 1640 Medium을 새 50ml 튜브에 넣습니다. 원심분리 후 혈액 함유 튜브에서 조밀한 백상을 준비된 RPMI 함유 튜브로 옮기고 차가운 RPMI로 최대 50ml까지 채웁니다.현탁액을 450G에서 섭씨 4도에서 10분간 원심분리하고 상층액을 버립니다. 펠릿을 10ml의 차가운 RPMI에 다시 현탁시키고 RPMI 1640으로 최대 50ml까지 채웁니다. 혼합물을 다시 원심분리하고 펠릿을 RPMI 50ml에 다시 현탁시킵니다.다시 샘플을 원심분리하고 세포 펠릿을 1.5ml의 차가운 단핵구 완충액에 다시 현탁시킵니다. 다음으로, 세포 현탁액에 250마이크로리터의 항 CD14 MicroBeads를 첨가하고 얼음에서 15분 동안 배양합니다. 배양 중에는 자기 분리기 랙에 필터를 부착하여 분리 컬럼을 준비합니다.평형을 위해 900마이크로리터의 단핵구 완충액을 컬럼에 추가합니다. 배양 후 세포 현탁액을 필터에 붓고 중력에 의해 폐기물 튜브로 흐르도록 합니다. 1ml의 단핵구 완충액을 추가하여 마그네틱 비드에 결합된 세포가 포함된 컬럼을 세척합니다.컬럼 아래의 waste 튜브를 20ml의 RPMI가 들어 있는 새 50ml 튜브로 교체합니다. 컬럼에 3ml의 단핵구 완충액을 추가합니다. 마그네틱 랙에서 컬럼을 제거하고 스탬프를 부착합니다.준비된 50ml 튜브에 세포를 누르고 RPMI로 최대 30ml까지 채웁니다. 광학 현미경으로 Neubauer 계수 챔버를 사용하여 세포를 계수하고 세포 수를 RPMI를 사용하여 10의 2배로 10 곱하기 6 세포의 거듭제곱으로 조정합니다. 6웰 챔버의 각 웰에 1ml의 세포 현탁액을 파종하고 섭씨 37도에서 5%의 이산화탄소로 2-4시간 동안 배양합니다.배양 후 세포가 제대로 부착되었는지 확인하고 RPMI를 1.5ml의 모노배지로 교체합니다. 단핵구가 대식세포로 분화할 때까지 최대 6일 동안 배양을 계속합니다. 6웰 플레이트의 기증자 혈액 샘플에서 1차 인간 대식세포를 추출한 후 500마이크로리터의 Accutase를 첨가하고 40분 동안 배양하여 대식세포를 분리합니다.그런 다음 500마이크로리터의 매체를 넣고 원심분리를 위해 15ml 원심분리 튜브로 옮깁니다. 그런 다음 2ml의 DPBS로 세포를 한 번 세척하고 Neubauer 챔버로 계산합니다. 내가 혼합한 40마이크로리터의 콜라겐에 원하는 수의 대식세포를 희석하고 튜브를 잠시 소용돌이칩니다.스페로이드를 세척하려면 300마이크로리터의 DPBS를 96웰 플레이트의 웰에 추가합니다. 끝이 잘린 1밀리리터 파란색 피펫 팁을 사용하여 DPBS로 스테로이드를 수집합니다. 스테로이드가 팁에 정착하면 피펫을 이미징 챔버 바닥으로 짧게 밀어 표면 장력에 의해 종양 스테로이드를 전달합니다.스테로이드로 전달된 잔류 DPBS를 가능한 한 많이 제거하십시오. 스테로이드가 들어있는 이미징 챔버에 콜라겐 I 대식 세포 혼합물 40 마이크로 리터를 신속하게 첨가하십시오. 콜라겐 혼합물을 완전히 중합하기 위해 습한 조건에서 섭씨 37도, 이산화탄소 5%에서 30분 동안 플레이트를 배양합니다.중합 후 각 웰에 25마이크로리터의 암세포 배지를 조심스럽게 추가하고 3일 동안 배양을 계속합니다. 원하는 시점에서 레이저 스캐닝 현미경을 사용하여 라이브 샘플을 이미지화합니다. H1299 GFP 스페로이드 면적은 침입 3일째에 40, 307 제곱 마이크로미터로 측정된 반면, 스페로이드 둘레는 1700.17 마이크로미터로 밝혀져 시간이 지남에 따라 성장을 나타냅니다.스페로이드에서 암세포의 집단적 침입이 관찰되었습니다. 51개의 분리된 입자가 확인되어 개별 암세포 침입에 대한 지표 역할을 했습니다. 스페로이드는 종횡비가 1.10, 원형도가 0.18로 유지되어 변형이 적었습니다.

a-macrophage-tumor-spheroid-co-invasion-assay

Research

연구

JoVE Journal

Cancer Research

암 연구

양적 성장 인자 (TGF) - β - 유도 3 차원 콜라겐 젤의 침공을 변형 측정하는 분석이 설명되어 있습니다. 이 분석은 유방암 개발의 다른 단계를 나타내는 세포 라인의 MCF10A 시리즈의 활용합니다. 이 방법은 다른 세포 라인과 함께 사용하는 다른 가능성 activators 또는 침해의 억제제를 조사하기 위해 사용될 수 채택 수 있습니다.

TGF - β - 유발 침략을 측정하는 회전 타원체 분석

이 동영상은 3차원 종양 스페로이드와 T 세포 공동 배양을 확립하는 방법을 보여줍니다. 종양 스페로이드를 함유하는 마이크로웰이 있는 아가로스 캐스트를 준비한 후 T 세포를 첨가합니다. 배양 후 이 설정을 통해 통제된 3차원 환경에서 T 세포와 종양 스페로이드의 상호 작용을 연구할 수 있습니다.

종양 스페로이드에 침투하는 T 세포의 3차원 공동 배양 모델

주변 정상 조직의 침입은 악성 종양을 정의하는 특징입니다. 우리는 여기에서 여러 진행성 인간 암 모델로 예시된 자연 3D 바이오매트릭스로의 침입에 대한 간단한 반자동 마이크로 플레이트 분석을 제공합니다.

3 차원 (3D) 종양 회전 타원체 침공 분석

이 방법은 스페로이드에서 주변 3D 매트릭스로의 암세포 침입을 평가합니다.  스페로이드는 행잉 드롭 배양 방법을 통해 생성된 다음 기저막 재료와 I형 콜라겐으로 구성된 매트릭스에 내장됩니다.  이후에 스페로이드 외부로의 침입이 모니터링됩니다.

암 세포 회전 타원체 분석은 3D 설정에 침략을 평가하기 위해

암의 악성 행동을 이해하려면 종양 세포가 대식세포와 같은 종양 미세환경의 구성 요소와 어떻게 상호 작용하는지에 대한 정확한 모델을 만들어야 합니다. 여기에서는 교모세포종 세포와 종양 관련 대식세포 및 교모세포종 침입에 대한 영향을 평가하는 미세아교세포와의 상호 작용을 연구하는 두 가지 방법을 설명합니다.

공동 배양 시험 법은 아교 모세포종 침략의 대 식세포와 미세 아교 세포 자극을 공부하기

종양 미세 환경은 암 성장과 침략의 필수적인 부분입니다. 암의 진행을 모방 하기 위해 생물학적으로 관련 된 인간 매트릭스가 필요 합니다. 이 프로토콜은 인간 평활 근 종 기반 매트릭스를 적용 하 여 시험관 내 3 차원 세 포스 페 로이드 침입 검정에 대 한 개선을 도입 한다. 이 프로토콜은 또한 컴퓨터 기반 세포 침입 분석을 소개 합니다.

3 차원 세 포스 페 로이드 침입 분석에서 완전 한 인간 종양 기반 매트릭스

본 문서는 대식세포를 유치하기 위해 종양 세포로부터 조절된 배지의 능력을 평가하는 유용한 시험관내 분석방법을 나타낸다.

종양 대식 세포 상호 작용을 연구 하는 시험관 내 분석

이 프로토콜의 목표는 면역 형광, 전사와 같은 다른 분석 시스템에서 해결 될 수있는 종양 벌크와 같은 환경에서 암 관련 섬유 아세포 (CAFs)의 분화를 연구하는 3D 체외 모델을 확립하는 것입니다. 분석 및 생명 세포 화상 진찰.

3D 스페로이드 모델은 시험관 내 암 관련 섬유아세포 분화 및 침입을 위한 보다 생리적 시스템으로

여기서, 우리는 종양 세포가 면역 반응을 억제하기 위해 사용하는 비접촉 파라크린 신호의 연구를 용이하게 하기 위해 투과막 지지대를 사용하는 방법을 제시한다. 시스템은 대식세포 활성화를 약화시키는 종양 분비 인자의 역할을 연구할 수 있습니다.

투과성 멤브레인 지지대를 이용한 공동 배양을 이용한 대식세포 활성화에 대한 종양 분비 파라크린 리간드의 효과 연구

제시된 접근은 3D 스페로이드 ascy 및 T 세포 세포 독성에 있는 암 세포 침략을 동시에 평가합니다. 스페로이드는 비계가 없는 아가로즈 멀티 마이크로웰 캐스트에서 생성됩니다. I형 콜라겐 매트릭스에 공동 배양 및 포함은 암세포 침입 및 T세포 중재 세포 독성을 모니터링할 수 있는 동일한 장치 내에서 수행된다.

3D 배양에서 암 세포 침략 및 T 세포 세포 독성 을 감시

여기에 제시된 스페로이드 이미징 장치의 제조를 위한 프로토콜이 있습니다. 이 장치는 암 세포 스페로이드의 동적 또는 세로 형광 이미징을 가능하게합니다. 이 프로토콜은 또한 암세포 침입의 분석을 위한 간단한 화상 처리 절차를 제공합니다.

3D 스페로이드 모델에서 암세포 침입의 시간 해결 형광 화상 진찰 및 분석

배우세요 대식세포와 종양 스페로이드의 3D 콜라겐 I 매트릭스 내 동시 침습 분석 방법을. KIF16B 결핍 대식세포가 암세포 침습을 감소시키는 역할을 확인하고, 거세포 표면 단백질 재활용이 종양 미세환경에 미치는 영향을 연구합니다.

대식세포-종양 스페로이드 동시 침습 분석

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