대식세포-종양 스페로이드 동시 침습 분석

우리는 전이 중에 암과 면역 세포가 어떻게 상호 작용하는지 더 잘 이해하기 위해 암과 면역 세포의 상호 작용을 조사하고자 합니다. 대부분의 경우, 생체 내 모델은 면역 체계의 맥락에서 암세포의 3D 침입에 관한 연구 질문을 추구하는 일상적인 방법이며, 시스템의 고립된 구성 요소에 초점이 맞춰져 있습니다. 생체 내 상황의 복잡성을 모방하지만 현미경으로 특정 환경 특성을 보다 직접적으로 조작할 수 있는 세포 거동을 분석할 수 있는 방법입니다.

우리는 변경되지 않은 암세포가 운동 단백질 KIF16B에 대해 고갈된 대식세포와 함께 배양될 때 3D 콜라겐 I 매트릭스의 침입을 감소시킨다는 것을 입증합니다. 이는 종양 미세환경에서 대식세포 표면 단백질의 KIF16B 주도 재활용의 역할을 가리킵니다. 우리는 대식세포 암세포 맥락의 인터페이스에서 기질 분해를 시각화할 수 있는 방식으로 방법을 지속적으로 개선하여 분해 및 접착 메커니즘을 더 잘 이해하고자 합니다.

시작하려면 섭씨 37도에서 25제곱센티미터 세포 배양 플라스크에 암세포 배지를 넣고 80% 합류점에 도달할 때까지 5%의 이산화탄소를 배양합니다. DPBS로 세포를 한 번 세척하고 세포가 분리될 때까지 2-3분 동안 1ml의 트립신-EDTA를 첨가합니다. 2ml의 암세포 배지를 첨가하여 효소 반응을 중단합니다.

다음으로, 분리된 세포 현탁액을 245G의 15ml 튜브에 넣고 5분 동안 원심분리합니다. 펠릿을 5ml의 DPBS로 세척하기 전에 트립신 용액이 포함된 상등액을 제거하십시오. 원심분리 후, 펠릿을 5ml의 암세포 배지에 다시 현탁시킵니다.

Neubauer 챔버를 사용하여 세포를 계산합니다. 8, 000 세포를 25 마이크로 리터의 암 세포 배지의 최종 부피에서 96 웰 초저 접착 플레이트로 옮깁니다. 세포를 섭씨 37도, 이산화탄소 5%에서 3일 동안 배양합니다.

3일 후 현미경으로 스페로이드의 균일성을 확인합니다. 인간 혈액 샘플을 채취한 후 수혈 백에서 20ml의 혈액을 50ml 반응 튜브로 옮깁니다. 15ml의 림프구 분리 배지를 새로운 50ml 튜브에 추가합니다.

20ml의 혈액을 섞지 않고 림프구 분리 배지 함유 튜브에 조심스럽게 옮기고 혼합물을 450G에서 섭씨 4도에서 30분 동안 원심분리합니다. 원심분리 중에 10ml의 차가운 RPMI 1640 Medium을 새 50ml 튜브에 넣습니다. 원심분리 후 혈액 함유 튜브에서 조밀한 백상을 준비된 RPMI 함유 튜브로 옮기고 차가운 RPMI로 최대 50ml까지 채웁니다.

현탁액을 450G에서 섭씨 4도에서 10분간 원심분리하고 상층액을 버립니다. 펠릿을 10ml의 차가운 RPMI에 다시 현탁시키고 RPMI 1640으로 최대 50ml까지 채웁니다. 혼합물을 다시 원심분리하고 펠릿을 RPMI 50ml에 다시 현탁시킵니다.

다시 샘플을 원심분리하고 세포 펠릿을 1.5ml의 차가운 단핵구 완충액에 다시 현탁시킵니다. 다음으로, 세포 현탁액에 250마이크로리터의 항 CD14 MicroBeads를 첨가하고 얼음에서 15분 동안 배양합니다. 배양 중에는 자기 분리기 랙에 필터를 부착하여 분리 컬럼을 준비합니다.

평형을 위해 900마이크로리터의 단핵구 완충액을 컬럼에 추가합니다. 배양 후 세포 현탁액을 필터에 붓고 중력에 의해 폐기물 튜브로 흐르도록 합니다. 1ml의 단핵구 완충액을 추가하여 마그네틱 비드에 결합된 세포가 포함된 컬럼을 세척합니다.

컬럼 아래의 waste 튜브를 20ml의 RPMI가 들어 있는 새 50ml 튜브로 교체합니다. 컬럼에 3ml의 단핵구 완충액을 추가합니다. 마그네틱 랙에서 컬럼을 제거하고 스탬프를 부착합니다.

준비된 50ml 튜브에 세포를 누르고 RPMI로 최대 30ml까지 채웁니다. 광학 현미경으로 Neubauer 계수 챔버를 사용하여 세포를 계수하고 세포 수를 RPMI를 사용하여 10의 2배로 10 곱하기 6 세포의 거듭제곱으로 조정합니다. 6웰 챔버의 각 웰에 1ml의 세포 현탁액을 파종하고 섭씨 37도에서 5%의 이산화탄소로 2-4시간 동안 배양합니다.

배양 후 세포가 제대로 부착되었는지 확인하고 RPMI를 1.5ml의 모노배지로 교체합니다. 단핵구가 대식세포로 분화할 때까지 최대 6일 동안 배양을 계속합니다. 6웰 플레이트의 기증자 혈액 샘플에서 1차 인간 대식세포를 추출한 후 500마이크로리터의 Accutase를 첨가하고 40분 동안 배양하여 대식세포를 분리합니다.

그런 다음 500마이크로리터의 매체를 넣고 원심분리를 위해 15ml 원심분리 튜브로 옮깁니다. 그런 다음 2ml의 DPBS로 세포를 한 번 세척하고 Neubauer 챔버로 계산합니다. 내가 혼합한 40마이크로리터의 콜라겐에 원하는 수의 대식세포를 희석하고 튜브를 잠시 소용돌이칩니다.

스페로이드를 세척하려면 300마이크로리터의 DPBS를 96웰 플레이트의 웰에 추가합니다. 끝이 잘린 1밀리리터 파란색 피펫 팁을 사용하여 DPBS로 스테로이드를 수집합니다. 스테로이드가 팁에 정착하면 피펫을 이미징 챔버 바닥으로 짧게 밀어 표면 장력에 의해 종양 스테로이드를 전달합니다.

스테로이드로 전달된 잔류 DPBS를 가능한 한 많이 제거하십시오. 스테로이드가 들어있는 이미징 챔버에 콜라겐 I 대식 세포 혼합물 40 마이크로 리터를 신속하게 첨가하십시오. 콜라겐 혼합물을 완전히 중합하기 위해 습한 조건에서 섭씨 37도, 이산화탄소 5%에서 30분 동안 플레이트를 배양합니다.

중합 후 각 웰에 25마이크로리터의 암세포 배지를 조심스럽게 추가하고 3일 동안 배양을 계속합니다. 원하는 시점에서 레이저 스캐닝 현미경을 사용하여 라이브 샘플을 이미지화합니다. H1299 GFP 스페로이드 면적은 침입 3일째에 40, 307 제곱 마이크로미터로 측정된 반면, 스페로이드 둘레는 1700.17 마이크로미터로 밝혀져 시간이 지남에 따라 성장을 나타냅니다.

스페로이드에서 암세포의 집단적 침입이 관찰되었습니다. 51개의 분리된 입자가 확인되어 개별 암세포 침입에 대한 지표 역할을 했습니다. 스페로이드는 종횡비가 1.10, 원형도가 0.18로 유지되어 변형이 적었습니다.