Name: 갓 얼어붙은 인간 뇌 절편에서 방출된 작은 세포외 소포에서 MicroRNA 화물의 힘 활용 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-11-08T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 55 s
Description: 배우세요 갓 얼어붙은 인간 뇌 조직에서 고속 원심분리와 크기 배제 크로마토그래피를 이용해 작은 세포외 소포를 분리하고 microRNA 바이오마커를 분석하는 방법을. 이 재현 가능한 프로토콜은 신경 질환의 조기 진단에 활용될 수 있습니다.

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<meta charset="utf8"></head><body>바이오마커 발견을 위한 최소 조직으로부터 뇌 sEV의 효율적인 분리

<ol><li>Jia, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+extracellular+vesicles+isolation+and+separation%3A+Current+techniques%2C+pending+questions+and+clinical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Theranostics%22%5BJournal%5D)">Small extracellular vesicles isolation and separation: Current techniques, pending questions and clinical applications.</a> Theranostics. 12 (15), 6548-6575 (2022).</li>
<li>Fornari, S., Schäfer, A., Jucker, M., Goriely, A., Kuhl, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prion-like+spreading+of+Alzheimer%27s+disease+within+the+brain%27s+connectome%5BTitle%5D)+AND+%22J+R+Soc+Interface%22%5BJournal%5D)">Prion-like spreading of Alzheimer's disease within the brain's connectome.</a> J R Soc Interface. 16 (159), 20190356(2019).</li>
<li>Zhang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor-derived+small+extracellular+vesicles+in+cancer+invasion+and+metastasis%3A+molecular+mechanisms%2C+and+clinical+significance%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cancer%22%5BJournal%5D)">Tumor-derived small extracellular vesicles in cancer invasion and metastasis: molecular mechanisms, and clinical significance.</a> Mol Cancer. 23 (1), 18(2024).</li>
<li>Constantinides, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CSF+A%CE%B242+and+A%CE%B242%2F+A%CE%B240+ratio+in+Alzheimer%27s+disease+and+frontotemporal+dementia%5BTitle%5D)+AND+%22Diagnostics%22%5BJournal%5D)">CSF Aβ42 and Aβ42/ Aβ40 ratio in Alzheimer's disease and frontotemporal dementia.</a> Diagnostics. 13 (4), 783(2023).</li>
<li>Cheng, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prognostic+serum+miRNA+biomarkers+associated+with+Alzheimer%27s+disease+shows+concordance+with+neuropsychological+and+neuroimaging+assessment%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Prognostic serum miRNA biomarkers associated with Alzheimer's disease shows concordance with neuropsychological and neuroimaging assessment.</a> Mol Psychiatry. 20 (10), 1188-1196 (2015).</li>
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<li>Jackson, N., Guerrero-Muñoz, M. J., Castillo-Carranza, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+prion-like+transmission+of+tau+oligomers+via+exosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Aging+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The prion-like transmission of tau oligomers via exosomes.</a> Front Aging Neurosci. 14, 974414(2022).</li>
<li>Vella, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rigorous+method+to+enrich+for+exosomes+from+brain+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J+Extracell+Vesicles%22%5BJournal%5D)">A rigorous method to enrich for exosomes from brain tissue.</a> J Extracell Vesicles. 6 (1), 1348885(2017).</li>
<li>Yousif, G., Qadri, S., Parray, A., Akhthar, N., Shuaib, A., Haik, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes+derived+neuronal+markers%3A+Immunoaffinity+isolation+and+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22Neuromolecular+Med%22%5BJournal%5D)">Exosomes derived neuronal markers: Immunoaffinity isolation and characterization.</a> Neuromolecular Med. 24 (3), 339-351 (2022).</li>
<li>Kumar, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+microfluidic+approaches+for+the+isolation+and+detection+of+exosomes%5BTitle%5D)+AND+%22TRAC-Trend+Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Recent advances in microfluidic approaches for the isolation and detection of exosomes.</a> TRAC-Trend Anal Chem. 159, 116912(2023).</li>
<li>Ransom, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+brain+small+extracellular+vesicles+contain+selectively+packaged%2C+full-length+mRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Human brain small extracellular vesicles contain selectively packaged, full-length mRNA.</a> Cell Rep. 43 (4), 114061(2024).</li>
<li>Gomes, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+isolation+method+for+spontaneously+released+extracellular+vesicles+from+brain+tissue+and+its+implication+for+stress-driven+brain+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Commun+Signal%22%5BJournal%5D)">A novel isolation method for spontaneously released extracellular vesicles from brain tissue and its implication for stress-driven brain pathology.</a> Cell Commun Signal. 21 (1), 35(2023).</li>
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<li>Théry, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minimal+information+for+studies+of+extracellular+vesicles+2018+%28MISEV2018%29%3A+a+position+statement+of+the+International+Society+for+Extracellular+Vesicles+and+update+of+the+MISEV2014+guidelines%5BTitle%5D)+AND+%22J+Extracell+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines.</a> J Extracell Vesicles. 7 (1), 1535750(2018).</li>
<li>Pirisinu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+long+journey+of+extracellular+vesicles+towards+global+scientific+acclamation%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Pharm+Bull%22%5BJournal%5D)">The long journey of extracellular vesicles towards global scientific acclamation.</a> Adv Pharm Bull. 13 (3), 489-501 (2023).</li>
<li>Bender, A., Sullivan, B. P., Lillis, L., Posner, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+and+chemical-based+methods+to+inactivate+endogenous+blood+ribonucleases+for+nucleic+acid+diagnostics%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Diagn%22%5BJournal%5D)">Enzymatic and chemical-based methods to inactivate endogenous blood ribonucleases for nucleic acid diagnostics.</a> J Mol Diagn. 22 (8), 1030-1040 (2020).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>소 혈청 알부민</td><td>Merck</td><td>A9418-100G</td><td></td></tr><tr><td>셀 마스크 주황색 플라즈마 멤브레인 염색</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>C10045</td><td></td></tr><tr><td>콜라겐 분해 효소 III형</td><td>StemCell Technologies</td><td>07422</td><td></td></tr><tr><td>ExoSpin 컬럼 및 버퍼</td><td>세포 유도 시스템 Ltd.</td><td>EX01-50</td><td>이 키트에는 이 실험에 사용된 SEC 컬럼, 침전 버퍼 및 EV 프리 PBS가 포함되어 있습니다.</td></tr><tr><td>Halt Protease Inhibitor Cocktail (100x)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>78429</td><td></td></tr><tr><td>Hibernate-E Medium</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A1247601</td><td></td></tr><tr><td>Laemmli Sample Buffer (4x)</td><td>BioRad</td><td>1610747</td><td></td></tr><tr><td>Lexogen Small RNA-Seq Library Prep Kit</td><td>Lexogen</td><td>052.24</td><td>이 키트에는 i7 Index 프라이머 플레이트가 있는 Small RNA 준비 시약 상자가 포함되어 있습니다.</td></tr><tr><td>miRNeasy Micro Kit (50)</td><td>Qiagen</td><td>217084</td><td>이 키트에는 고품질 RNA 회수 용해 시약(Qiazol), RNA 분리 컬럼, 분리 버퍼(RWT, RPE) 및 RNase free water가 포함되어 있습니다.</td></tr><tr><td>MiSeq 시약 키트 v3</td><td>Illumina</td><td>MS-102-3001</td><td>이것은 Illumina 준비 키트</td></tr><tr><td>니트로셀룰로오스 막, 0.45 &mu; m</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>88018</td><td></td></tr><tr><td>PE/Dazzle 594 anti-human CD63 Antibody</td><td>BioLegend</td><td>143914</td><td>fNTA 분석에 사용</td></tr><tr><td>PE/Dazzle 594 anti-human CD81 항체</td><td>BioLegend</td><td>349520</td><td>fNTA 분석에 사용</td></tr><tr><td>PE/Dazzle 594 anti-human CD9 항체</td><td>BioLegend</td><td>312118</td><td>fNTA 분석에 사용</td></tr><tr><td>PhosSTOP</td><td>Merck</td><td></td><td></td>4906845001</tr><tr><td>Pierce BCA 단백질 어세이 키트</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>25530049</td><td></td></tr><tr><td>Qubit microRNA 어세이 키트</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Q32880</td><td></td></tr><tr><td>Qubit 1X dsDNA HS 어세이 키트</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Q33230</td><td></td></tr><tr><td>Qubit 3.0 형광측정기</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Q33216</td><td></td></tr><tr><td>RIPA 용해 및 추출 버퍼</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>89901</td><td></td></tr><tr><td>RNase A</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>EN0531</td><td></td></tr><tr><td>SuperSignal West Femto 최대 감도 기판</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>34094</td><td></td></tr></tbody></table>

갓 얼어붙은 인간 뇌 절편에서 방출된 작은 세포외 소포에서 microrna 화물의 힘 활용 

Harnessing the Power of MicroRNA Cargoes in Small Extracellular Vesicles Released from Fresh-Frozen Human Brain Sections

BDsEV의 존재를 확인하기 위해 웨스턴 블로팅(western blotting), NTA 및 TEM의 세 가지 기술이 사용되었습니다(그림 3). 웨스턴 블롯 결과(그림 3A 및 보충 파일 1)는 5개의 양성 마커(CD9, CD63, CD81, Flot-1 및 TSG101)가 모두 존재하고 sEV(음성 대조군으로 사용됨)에 Calnexin이 없음을 보여 세포 내용물에 대한 오염이 없음을 확인합니다. 예상대로 뇌 균질체(BH)는 테스트된 마커에 대한 sEV에서 관찰된 것보다 더 많은 단백질을 보여줍니다. TEM 이미지는 BDsEV의 형태와 샘플 내 상대적 크기를 확인했으며(그림 3B), 이는 나노 입자 추적 분석(그림 3C)을 통해 추가로 확인되었습니다.
그림 3C (상단 패널)는 50-200nm 사이의 분리된 입자 크기를 보여줍니다. NTA 데이터에서 산란 결과를 표시된 입자의 100%로 취하면 CMO는 지질 이중층을 갖는 입자(그림 3C, 하단 패널)의 약 52.35%를 나타냅니다. 이러한 CMO 염색 입자 중 34.66%는 CD9, 15.49%는 CD63, 12.01%는 CD81을 함유했습니다. NTA 제어 데이터에 대해서는 보충 파일 2 를 참조하십시오.
분리된 RNA의 정량화 데이터(표 2)는 3.24-8.76(ng/μL) 범위의 수준을 보여주며, 이는 cDNA 라이브러리를 생성할 때 정규화된 값입니다. TapeStation 분석 결과(그림 4)는 약 120-160 bp의 주요 피크를 보여주며, 이보다 낮은 피크는 약 50 bp이고 다른 작은 피크는 약 484 bp입니다.
차세대 염기서열분석 데이터에 대한 품질 검사는 어댑터 트리밍 후 매우 높은 품질의 판독을 보여줍니다(그림 5A). 모든 염기서열 위치는 &gt;30의 Phred 점수를 나타내며, 이는 1000개의 뉴클레오티드 중 1개 미만의 오류율을 나타냅니다. 그림 5B 는 대부분의 염기서열이 약 21-22 bp임을 보여주며, 이는 microRNA의 예상 크기 범위와 일치합니다. Samtools 플래그스타트 분석 바이오툴을 사용하여 추가 다운스트림 매핑(BowTie2 사용)을 통해 1,304,100개의 정렬된 염기서열 중 1,116,264개(85%)가 인간 게놈의 microRNA 영역(빌드 hg38; 표 3).
총 miRNA 중 808개의 miRNA가 3개의 샘플 모두를 통해 발현되었으며, 3개의 샘플 모두에서 344개의 miRNA가 공유되고(~43%), 대조군 1과 대조군 2에서 5개가 공유되고, 대조군 1과 대조군 3에서 183개가 공유되고, 대조군 2와 대조군 3에서 16개가 공유되었습니다(그림 6). 이 데이터에서 세 가지 BDsEV 모두에서 가장 많이 발현된 miRNA는 has-let-7b-5p, has-miR-143-3p, has-miR-30a-5p, has-miR-221-3p 및 has-let7i-5p입니다. 마찬가지로, BDsEV 샘플(판독 &gt;10)에서 가장 적게 차등적으로 발현된 상위 5개의 miRNA는 has-miR-128-2-5p, has-miR-182-5p, has-miR-193b-5p, has-miR-448 및 has-miR-505-3p입니다. 모든 원시 및 정규화된 읽기 횟수는 보충 파일 3에 제공됩니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67379/67379fig01.jpg"> 
그림 1: 조직 처리 워크플로우. 이 그림은 크기 배제 크로마토그래피를 사용하여 신선 냉동 뇌 절편에서 뇌 유래 sEV(BDsEV)를 분리하는 단계별 프로세스를 보여줍니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67379/67379fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67379/67379fig02.jpg"> 
그림 2: BDsEV의 RNA 분리 워크플로우. 이 그림은 proteinase K 및 RNase A를 사용하여 세포외 RNA를 제거하는 전처리 단계를 포함하여 BDsEVs에서 total RNA를 분리하는 단계적 프로세스를 보여줍니다. 이 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67379/67379fig02large.jpg" target="_blank">그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67379/67379fig03.jpg"> 
그림 3: BDsEV 특성화 워크플로우. 이 그림은 BDsEV를 특성화하는 다양한 방법을 보여줍니다. (A) sEV 특이적 단백질 마커를 검출하기 위한 웨스턴 블롯. BH 뇌 균질화. Calnexin은 sEV에 대한 음성 대조군으로, sEV의 부재 및 BH의 존재는 sEV 시료의 순도를 확인합니다. 다른 마커의 경우, 예상대로 단백질 양은 sEV 샘플보다 BH에서 더 높습니다(웰당 20μg의 단백질이 로드됨). (B) 200μM 스케일의 BDsEV에 대한 대표 투과 전자 현미경(TEM) 이미지로, 지질 이중층 막으로 예상되는 형태를 확인합니다. (C) 모든 입자에 대한 나노 입자 추적 분석(NTA)을 위한 크기 분포 플롯(상단 패널). 각 데이터 점은 3개의 반복실험에 걸친 변동을 나타냅니다. 생물학적 입자(sEV)에 대한 정규화된 비율 및 특정 표면 마커(하단 패널)에 대한 상대적 비율(3중 웰의 평균 ± SEM으로 표시된 데이터(n = 3)). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67379/67379fig03large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67379/67379fig04.jpg"> 
그림 4: cDNA 라이브러리 준비를 위한 품질 검사. cDNA 라이브러리 전처리 후 개별 샘플에 대한 Tapestation 분석. 각 그래프에 표시된 피크는 각 준비의 크기(가로 축, bp)와 각 피크의 각 강도(세로 축, FU)를 표시합니다. 그림에서 볼 수 있듯이 예상되는 small RNA library는 약 120-160bp에서 최고조에 달합니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67379/67379fig04large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67379/67379fig05.jpg"> 
그림 5: miRnome 염기서열분석에 대한 품질 검사. (A) 어댑터 트리밍 후 개별 샘플의 판독 품질에 대한 FASTQC 플롯. 가로축은 뉴클레오티드 위치를 나타내고, 세로축은 Phred 점수를 나타냅니다. 각 위치에 대한 상자 그림은 각 위치에 대한 모든 읽기에 걸친 Phred 점수의 분포를 보여줍니다. 녹색 영역 내의 모든 분포는 고품질 샘플 준비를 암시하는 매우 높은 품질의 데이터(&gt;Q30)를 확인합니다. (B) 각 샘플에 대한 염기서열 길이 분포는 세 샘플 모두에 대해 대부분의 판독이 약 21-22개의 뉴클레오티드(microRNA의 예상 크기 범위)임을 보여줍니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67379/67379fig05large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67379/67379fig06.jpg"> 
그림 6: 모든 샘플에서 MicroRNA 발현의 중복. 각 샘플에서 검출된 miRNA의 수(판독 횟수 ≥ 10)와 하나 이상의 샘플에서 공유되는 특정 microRNA가 벤 다이어그램에 나와 있습니다. 모든 원시 및 정규화된 읽기는 보충 파일 3에 표시됩니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67379/67379fig06large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>항체 에피토프</td>
			<td>항체의 희석 인자 </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>마우스 Anti-CD9</td>
			<td>1:2000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>마우스 안티 CD63</td>
			<td>1:2000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>마우스 안티-CD81</td>
			<td>1:2000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>마우스 안티 플로틸린 1</td>
			<td>1:2000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>마우스 안티-TSG101</td>
			<td>1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>마우스 안티 칼넥신</td>
			<td>1:10 000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse 2차 항체</td>
			<td>1:3000</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
표 1: BDsEV의 특성화에 사용되는 항체 에피토프 및 각각의 희석 인자. 
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>견본</td>
			<td>miRNA 농도 (ng/μL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1</td>
			<td>8.76</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2</td>
			<td>3.24</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3</td>
			<td>5.33</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
표 2: 분리된 RNA의 정량화 데이터.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>견본</td>
			<td>정렬된 시퀀스</td>
			<td>매핑된 miRNA</td>
			<td>백분율(%)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>대조 시료 1</td>
			<td>1 444 665</td>
			<td>1 133 437</td>
			<td>78.46</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>대조 시료 2</td>
			<td>442 808</td>
			<td>381 631</td>
			<td>86.18</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>대조 샘플 3</td>
			<td>2 024 828</td>
			<td>1 983 726</td>
			<td>97.97</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>평균의</td>
			<td>1 304 100.33</td>
			<td>1 166 264.67</td>
			<td>89.43</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
표 3: 정렬되고 성공적으로 매핑된 miRNA 염기서열의 양. 
보충 파일 1: 보충 웨스턴 블롯 분석 데이터. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67379/Supplementary%20File%201.pdf" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 파일 2: 보충 NTA 제어 데이터. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67379/Supplementary%20File%202.pdf" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 파일 3: miRNA 발현 분석의 원시 및 정규화된 판독 횟수. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67379/Supplementary%20File%203.xlsx" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 파일 4: 보충 단백질 농도 데이터. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67379/Supplementary%20File%204.pdf" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>

갓 얼어붙은 인간 뇌 절편에서 방출된 작은 세포외 소포에서 MicroRNA 화물의 힘 활용 

Small extracellular vesicles (sEVs) are crucial mediators of cell-cell communication, transporting diverse cargoes like proteins, lipids, and nucleic ...

harnessing-power-microrna-cargoes-small-extracellular-vesicles

Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

마우스 뇌의 특정 영역별 RNA 발현 프로파일링을 위해서는 정밀하고 재현 가능한 조직 수집 전략이 필요합니다. 본 문서에서는 관상면 뇌 절단과 조직 코어러(corer) 보조 미세 절제술을 모두 사용하는 프로토콜을 설명합니다. 결과 샘플에서 얻은 총 RNA의 수율과 품질은 상술한 방법의 유용성을 입증합니다.

총 RNA의 분리 및 다운 스트림 차세대 시퀀싱 및 유전자 발현 프로 파일링에 대한 개별 마우스 뇌 영역의 Microdissection 아닌 레이저 캡처 현미경 접근법

마이크로 RNA는 뇌의 구조와 기능에 중요한 역할을한다. 여기에 우리가 과다 발현은 설계 miRNA의 발현 렌티 바이러스의 정위 주사를 사용하여 해마 miRNA의를 적용하는 방법을 설명합니다. 이 방법은을 평가하는 상대적으로 빠른 방법으로 사용할 수...

의 정위 주입 MicroRNA의 발현 마우스 해마 CA1 영역으로 렌티 바이러스 및 행동 결과의 평가

우리는 정량 실시간 PCR 및 / 또는 전체를 게놈 microarrays를 사용하여 후속 유전자 발현 분석을위한 부상을 쥐의 뇌의 냉동 섹션에서 hippocampal 뉴런 또는 단일 뉴런의 풍부한 인구를 얻기 위해 레이저 캡처 microdissection (LCM)를 사용하는 방법에 대해 설명합니다.

외상성 뇌 손상 후 뉴런 또는 유전자 발현 분석을위한 단일 뉴런의 강화 인구의 레이저 캡처 Microdissection

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정량 실시간 PCR을 사용하여 뇌척수액의 마이크로 RNA 프로파일

MicroRNAs는 뇌에서 중요한 역할을 하며 신경 퇴행을 모델링하기 위한 잠재적인 표적입니다. 그러나 miRNA의 길이가 짧고 뇌 조직에 접근하기 어렵기 때문에 miRNA 수치를 교란하는 것은 어렵습니다. 이 비디오는 마우스에서 뉴로펩타이드를 사용하여 antagomir 설계 및 뇌 특이적 전달 방법을 제시합니다.

miRNA의 뇌의 특정 최저 대한 정위 주입하는 간단한 대안

본 프로토콜은 내부 경동맥을 통해 뇌로 물질을 직접 효과적으로 전달하는 마우스 미세 수술 주입 기술을 설명합니다.

중추 신경계에 대상 물질 전달을위한 마우스 미세 주입 기술를 통해 내부 경동맥

이 프로토콜은 인공 예측에 관한 중재 RNA 간섭 그대로 신경 회로 내에서 선택적 gene(s)의 감소 식이 구체적으로 연 접 boutons를 자극 하는 optogenetics와 결합 하는 방법에 대 한 워크플로우를 제공 합니다.

연 접 기능 그대로 신경 회로 내에 유전자 최저 효과 특성 인공 microRNAs Optogenetics 결합

이 프로토콜에서는 작은 RNA 도서관 건설 및 다음 세대 시퀀싱에 대 한 세포 배양에서 세포 외 microRNAs 정화 하는 방법을 보여 줍니다. 다양 한 품질 관리 검사점 작업 exRNAs 같은 낮은 입력된 샘플을 할 때 기대 하는 것을 이해 하는 독자 수 있도록 기술 된다.

격리, 시퀀싱 및 인간 중간 엽 줄기 세포에서 세포 외 MicroRNAs 분석

우리는 성인 마우스 뇌 반구의 다른 해부 된 영역에서 microglia의 격리를위한 프로토콜을 제공하고, 전체 길이 전사체의 깊은 단일 세포 RNA 시퀀싱을위한 반자동 라이브러리 준비를 제공합니다. 이 방법은 건강과 질병에서 microglia의 기능적 이질성을 해명하는 데 도움이됩니다.

깊은 단세포 RNA 염기서열 분석에 대한 하나의 성인 마우스 뇌 반구에서 영역 별 Microglia의 격리

이 절차는 저렴하고 일반적으로 사용할 수있는 도구를 사용하여 고품질의 단백질과 RNA를 얻기 위해 이산 냉동 뇌 영역의 수집을 설명합니다.

다운스트림 분석을 위한 냉동 설치류 뇌 영역 모음

여기에서는 성체 쥐 뇌실 영역에서 분리된 확장된 신경 줄기 세포(NSC)에서 유전자 전달 효율성을 향상시키도록 설계된 핵절충 시스템에 대해 설명합니다. 이 연구 결과는 이 방법이 NSC의 유전자 섭동을 크게 개선하여 기존 transfection 프로토콜의 효과를 능가하고 세포 생존율을 향상시킨다는 것을 보여줍니다.

Isolation, Expansion, and Nucleofection of Neural Stem Cells from Adult Murine Subventricular Zone

배우세요 갓 얼어붙은 인간 뇌 조직에서 고속 원심분리와 크기 배제 크로마토그래피를 이용해 작은 세포외 소포를 분리하고 microRNA 바이오마커를 분석하는 방법을. 이 재현 가능한 프로토콜은 신경 질환의 조기 진단에 활용될 수 있습니다.

갓 얼어붙은 인간 뇌 절편에서 방출된 작은 세포외 소포에서 MicroRNA 화물의 힘 활용

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