Name: 여성 Drosophila melanogaster 생식세포 줄기세포 틈새의 확장된 라이브 이미징 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-12-20T13:50:00.000+00:00
Duration: 7 min 10 s
Description: 배우세요 Drosophila melanogaster 난소 틈새에서 생식세포 줄기세포의 비대칭 분열을 GFP 융합 단백질을 이용한 라이브 이미징으로 관찰하는 방법을. 이 기법은 세포 주기 전체와 스펙트로솜 역학을 연구하는 데 필수적입니다.

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원고에 도움이 되는 의견을 제시해 주신 Acaimo González Reyes와 María Olmedo López에게 감사드립니다. 이 연구는 PID2021-125480NB-I00 (H. S-G), Junta de Andalucía (J. G-M)의 "Ayudas a la contratación de personal Investigador Doctor", VI 및 VII PPIT-Seville University (P. R-R)의 "Ayuda a proyectos de investigación precompetitivos" 및 VI PPIT-Seville University (P. R-R)의 "Contrato de Acceso de I+D+i"의 지원을 받았습니다. 원본 출판물(doi:10.1242/DEV.199716)에서 각색된 이미지를 공유할 수 있는 권리를 친절하게 제공한 Company of Biologists Ltd에 감사를 표합니다.

참고: 1.4단계는 최소 2일 전에 완료해야 합니다. 2.1단계와 2.2단계는 1일 전에 수행할 수 있습니다.
1. 실험 전 설정 I
<ol>
	<li>스트렙토마이신/페니실린 항생제 혼합물(10,000 U/mL 페니실린 및 10 mg/mL 스트렙토마이신) 100 μL 분취액을 준비하고 사용할 때까지 -20 °C에서 보관합니다.</li>
	<li>오토클레이브 순수를 사용하여 15mL의 용액을 준비하고 4°C에서 보관하고 한 달 이내에 사용하십시오: 중탄산나트륨(NaHCO3) 0.1M pH 8.0 및 0.1% Tween 20.</li>
	<li>오염을 방지하기 위해 층류 후드에서 다음 배양 배지와 용액을 준비합니다. 멸균된 필터 팁과 튜브를 사용하십시오.
	<ol>
		<li>희석되지 않은 소 태아 혈청(FBS) 분취액 2mL를 준비하고 무균 조건에서 사용할 때까지 -20°C에서 보관합니다.</li>
		<li>15% FBS 및 0.6% 스트렙토마이신/페니실린 항생제 혼합물이 보충된 Schneider의 초파리 배지를 준비합니다. 7mL의 부분 표본을 준비하고 4°C에서 보관합니다. 하나의 부분 표본은 두 개의 MatTek 플레이트에 충분합니다(섹션 2 참조).
		<ol>
			<li>Ringer's solution(고압멸균된 순수에 128 mM NaCl, 2 mM KCl, 1.8 mM CaCl2, 4 mM MgCl2, 35.5 mM Sucrose, 5 mM Hepes, pH 6.9)을 준비합니다. 1mL 부분 표본을 준비하고 사용할 때까지 -20°C에서 보관합니다.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>GFP(poly Ubiquitin-mGFP6::p ar-1 line)에 융합된 Par-1 단백질을 구성적으로 그리고 유비쿼터스하게 발현하는 1-2일 된 파리를 모아 효모 분말이 보충된 플라이 푸드가 있는 새 튜브에 넣습니다. 해부 전에 인큐베이터에서 25 °C에서 2 일 동안 배양하십시오 . 
	참고: 이 단계는 관심 있는 형광 태그가 지정된 기자로 수행할 수 있습니다.</li>
</ol>
2. 유리 바닥 판 코팅 및 준비
<ol>
	<li>특정 Cell-Tak 접착제(이하 세포 및 조직 접착제라고 함)를 3mm poly-D-lysine 코팅 플레이트(유리 바닥 접시, 재료 표 참조)의 커버슬립 중앙에 수동으로 펴지 않고 3μL 방울 떨어뜨립니다. 멸균 팁을 사용하십시오. 
	참고: 세포 및 조직 접착제는 4°C에서 보관해야 합니다. 두 가지 유전 질환(일반적으로 대조군 및 돌연변이 질환)을 사용한 실험의 경우, 잘 분리된 두 방울의 접착제를 동일한 유리 바닥판에 떨어뜨립니다. 이렇게 하면 두 유전적 배경이 동일한 조건에서 이미지화됩니다.</li>
	<li>그 직후, 0.1M NaHCO3 pH 8.0의 동일한 부피(이 프로토콜 설정에서는 3 μL)를 제조업체에서 권장하는 3 μL 접착제 방울에 조심스럽게 첨가하고 피펫팅으로 혼합합니다.</li>
	<li>완전한 증발을 위해 플레이트를 실온(RT)에서 20분 동안 배양한 다음 다음날 사용할 수 있도록 4°C에서 하룻밤 동안 유지합니다. 또는 준비된 플레이트를 37°C에서 완전히 증발할 때까지 25분 동안 배양하고 다음 단계로 바로 진행합니다. 두 경우 모두 덮개가 있는 플레이트를 유지하십시오. 멸균 팁을 사용하십시오.</li>
	<li>준비된 유리 바닥 접시를 사용하기 전에 15-20분 동안 벤치에 놓아 RT에 도달하도록 합니다.</li>
	<li>준비된 접시를 3번 조심스럽게 씻습니다. 접착층을 만지거나 방해하지 마십시오. 각 세척에서 6μL의 오토클레이브 순수를 첨가한 다음 NaHCO3 용액의 잔류물을 제거하기 위해 세 번의 세척 각각에 대해 깨끗한 팁을 사용하여 물을 제거합니다.</li>
	<li>깨끗하고 준비된 플레이트를 RT에 놓고 뚜껑을 덮은 상태에서 5-10분 동안 해부하여 먼지 입자를 방지하여 물이 완전히 증발할 수 있도록 합니다.</li>
</ol>
3. 초파리 난소 박리 및 난소 분리 및 장착
참고: 난소 박리는 샘플 조직이 접착제에 달라붙는 것을 방해할 수 있는 단백질의 존재를 방지하기 위해 FBS 없이 Ringer's solution(Schneider's medium) 대신 Ringer's solution에서 수행됩니다.
<ol>
	<li>시작하기 전에 3웰 해부 접시, 집게, 해부 바늘을 70% 에탄올로 세척하십시오.</li>
	<li>3개의 웰 각각에 충분한 부피(~200μL)의 Ringer's solution을 추가합니다.</li>
	<li>표준 절차10,11에 따라 두 쌍의 집게를 사용하여 첫 번째 웰에서 Ringer's 용액 200μL에 있는 효모를 먹인 암컷 5마리의 난소를 절개합니다. 흉부와 복부의 교차점에 있는 초파리 암컷을 집게 중 하나로 잡습니다. 그런 다음 후복부의 큐티클을 부드럽게 찢고 두 개의 난소가 드러날 때까지 복부 큐티클을 당깁니다.</li>
	<li>절개된 난소를 두 번째 웰로 옮겨 해부로 인한 다른 조직의 잔해나 파편으로 인한 오염을 줄입니다.</li>
	<li>발광 다이오드(LED) 조명과 미세한 점겸자가 있는 실체현미경(줌 8X-13.5X)을 사용하여 15-20개의 난소의 근육초를 제거합니다. 한 쌍의 집게를 사용하여 난소 전체를 고정하고 두 번째 집게를 사용하여 후기 단계의 난실을 부드럽게 잡고 근육이 부러지고 뒤처질 때까지 부드럽게 스트레칭합니다. 
	참고: 난소의 이 부분과의 접촉을 줄이는 것만으로도 저마리아의 손상을 방지하는 것이 중요합니다. 8-9단계보다 오래된 난자를 제거합니다.</li>
	<li>겸자를 사용하여 15-20개의 근육초가 없는 난소를 200μL의 Ringer's medium이 들어 있는 세 번째 웰로 하나씩 옮깁니다.</li>
	<li>피펫팅으로 20-200 μL 팁을 0.1% Tween 20으로 미리 적십니다. 이것은 난소가 끝의 플라스틱 벽에 접착되는 것을 방지합니다.</li>
	<li>미리 적신 팁을 사용하여 근육초가 없는 난소를 포함하는 Ringer's 용액 6μL를 준비된 접착판(RT로 유지)으로 옮깁니다. 
	알림: 난소 침착(다음 단계) 후 게르마리아 박리를 방지하기 위해 팁과 접착층 사이의 모든 접촉을 피하십시오. 약 30%의 제르마리아가 예상대로 부착되지 않습니다.</li>
	<li>이식된 난소가 접착 표면에 부착되도록 하려면 해부 바늘이나 집게를 사용하여 접착 표면에 닿을 때까지 Ringer의 방울 바닥까지 조심스럽게 누릅니다. 
	알림: 일단 난소가 가라앉으면 난소를 재배열하려고 하지 마십시오.</li>
	<li>15% FBS 및 0.6% 스트렙토마이신/페니실린 항생제 혼합물이 보충된 슈나이더 배지 3mL로 MatTek 플레이트를 조심스럽게 채웁니다(1.3단계). 난소가 박리되는 것을 방지하려면 플레이트의 바깥쪽 가장자리 주위에 한 번에 1mL씩 천천히 추가합니다.</li>
	<li>평평한 표면에 근육초가 없는 난소가 들어 있는 플레이트를 현미경 스테이션으로 운반합니다.</li>
</ol>
4. 컨포칼 현미경을 사용한 라이브 이미징
<ol>
	<li>스피닝 디스크 현미경 또는 컨포칼 현미경(유사한 장비를 사용할 수 있음)의 63x 대물렌즈에 플레이트를 놓고 샘플의 초점을 맞춥니다. 각 germarium에 대한 중간 z 평면을 선택합니다.</li>
	<li>다음 실험 매개변수를 구성합니다: 캡처 유형: 3D 타임랩스, 70/100의 레이저 출력 조정, 여기 파장: 488nm, z 스택 범위: 30μm 및 Z 스택 간 거리: 1.2μm, 지속 시간: 17시간, 시점 간 간격: 10분마다.</li>
	<li>사용 가능한 경우 다중 위치 옵션을 사용하여 샘플의 XY 좌표를 재정의하고 Z 스택이 이 위치의 중앙에 배치되므로 각 germarium의 중간에 있는 Z 평면을 선택합니다. 획득 시작. 
	참고 : germarium의 정상 너비는 30 μm이므로 각 Z 스택은 ~ 25-27 섹션이됩니다. 컨포칼에 따라 10분 간격 내에 최소 25개의 germaria를 이미지화할 수 있습니다. 일반적으로 40x/1.30 NA 또는 63x/1.40 NA 오일 이멀젼, 플라나포 보정 대물렌즈가 사용됩니다.</li>
	<li>Imaris 또는 ImageJ(피지) 소프트웨어를 사용하여 시간 및 Z축에서 이미지를 분석하여 spectrosome morphology의 특정 변화를 시각화합니다12,13. 관찰에 대한 특정 시간이 표시됩니다(그림 1B'). 동영상을 마운트하려면 각 시점에서 최상의 Z 평면을 수동으로 선택합니다.</li>
</ol>

Real-Time Imaging of Germline Stem Cells in Drosophila Ex Vivo Germaria Culture

<ol><li>Li, L., Xie, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cell+niche%3A+structure+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Stem cell niche: structure and function.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 21, 605-631 (2005).</li>
<li>Drummond-Barbosa, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+and+physiological+control+of+germline+stem+cell+lineages+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Local and physiological control of germline stem cell lineages in Drosophila melanogaster.</a> Genetics. 213 (1), e234(2019).</li>
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<li>Huynh, J. R., Shulman, J. M., Benton, R., St Johnston, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PAR-1+is+required+for+the+maintenance+of+oocyte+fate+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">PAR-1 is required for the maintenance of oocyte fate in Drosophila.</a> Development. 128 (7), 1201-1210 (2001).</li>
<li>Villa-Fombuena, G., Lobo-Pecellín, M., Marín-Menguiano, M., Rojas-Ríos, P., González-Reyes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+the+Drosophila+ovarian+niche+shows+spectrosome+and+centrosome+dynamics+during+asymmetric+germline+stem+cell+division%5BTitle%5D)+AND+%22Development+%28Cambridge%29%22%5BJournal%5D)">Live imaging of the Drosophila ovarian niche shows spectrosome and centrosome dynamics during asymmetric germline stem cell division.</a> Development (Cambridge). 148 (18), dev199716(2021).</li>
<li>De Cuevas, M., Spradling, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphogenesis+of+the+Drosophila+fusome+and+its+implications+for+oocyte+specification%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Morphogenesis of the Drosophila fusome and its implications for oocyte specification.</a> Development. 125 (15), 2781-2789 (1998).</li>
<li>Wong Li, C., Schedl, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissection+of+Drosophila+ovaries%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Dissection of Drosophila ovaries.</a> J Vis Exp. (1), 52(2006).</li>
<li>Merkle, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissection%2C+fixation%2C+and+standard+staining+of+adult+Drosophila+ovaries%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Dissection, fixation, and standard staining of adult Drosophila ovaries.</a> Methods Mol Biol. 2626, 49-68 (2023).</li>
<li>Thévenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+pyramid+approach+to+subpixel+registration+based+on+intensity%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Trans+Image+Process%22%5BJournal%5D)">A pyramid approach to subpixel registration based on intensity.</a> IEEE Trans Image Process. 7 (1), 27-41 (1998).</li>
<li>Miura, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bleach+correction+ImageJ+plugin+for+compensating+the+photobleaching+of+time-lapse+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22F1000Res%22%5BJournal%5D)">Bleach correction ImageJ plugin for compensating the photobleaching of time-lapse sequences.</a> F1000Res. 9, 95(2020).</li>
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<li>Sohr, A., Du, L., Roy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+Drosophila+wing+imaginal+disc+culture+and+furin+inhibitor+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Bio+Protoc%22%5BJournal%5D)">Ex vivo Drosophila wing imaginal disc culture and furin inhibitor assay.</a> Bio Protoc. 9 (16), e3336(2019).</li>
<li>Anllo, L., Plasschaert, L. W., Sui, J., DiNardo, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+reveals+hub+cell+assembly+and+compaction+dynamics+during+morphogenesis+of+the+Drosophila+testis+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Live imaging reveals hub cell assembly and compaction dynamics during morphogenesis of the Drosophila testis niche.</a> Dev Biol. 446 (1), 25-34 (2019).</li>
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</ol>

저자는 경쟁하는 금전적 이해관계가 없음을 선언합니다.

여기에서 우리는 최대 16시간의 장기간 동안 Drosophila melanogaster GSC 틈새를 모니터링하는 프로토콜을 제시합니다. 초파리 생물학적 과정을 생체 외에서 촬영하는 대부분의 프로토콜은 더 짧은 시간 창에 초점을 맞추고 있으며 상상의 날개 디스크(15,16,17), 배아 생식선(18,19) 또는 난소(20,21,22,23)에 대해 여러 예를 찾을 수 있습니다 . 확실히 이미지 획득 기간은 면밀히 조사되는 발달 과정에 따라 다릅니다. 일시적인 사건은 세포 유형 및 생리학적 조건에 따라 밀리초에서 초까지 다양할 수 있는 범위에서 발생할 수 있는 반면24, 세포 분열과 같은 다른 과정은 관찰할 수 있도록 몇 시간 또는 며칠의 촬영이 필요할 수 있다. 특히, 초파리 암컷 GSC의 세포주기는 완료되기까지 약 12-14시간이 걸립니다25. Villa-Fombuena et al. (2021)8, 분광체 형태의 변화에 대한 연구에 의해 결정된 바와 같이 전체 주기의 지속 시간 추정은 15.5시간이었습니다. 이 이미징 방법과 염색질 마커 및/또는 Fly-FUCCI 기술(26)의 조합은 GSC가 일반적으로 15.5시간마다 분열되고 세포 주기 단계의 평균 지속 시간이 M(원형 모양, 22분), G1(원형 G1, 플러그 및 막대 모양, 3.45시간), S(융합 모양, 43분) 및 G2(융합, 느낌표 및 원형 모양, 10.5시간). 세포 주기 단계의 지속 시간에 관한 원시 데이터는 Villa-Fombuena et al.8에 나와 있습니다. 이러한 관찰은 GSC 세포 주기 및 퓨솜 형태를 분석하기 위해 고정 이미징을 사용한 이전 연구와 일치했습니다 25,27,28. 또한, 이 생체 내 방법은 퓨솜이 이러한 사건에서 중요한 역할을 하기 때문에 다운스트림 난모세포 선택에서 비정상적인 GSC 분열 및/또는 분광체 역학의 다운스트림 결과를 해독하는 데 도움이 될 수 있습니다. 또한, 이 프로토콜은 확립되거나 새로운 돌연변이체에서 GSC 분열률을 분석하는 데 적용될 수 있습니다.
장시간 동안 이미지를 지속적으로 획득한다는 것은 주로 조직 무결성과 기능의 유지, 샘플의 형광 보존 등 고려해야 할 일련의 중요한 문제를 의미합니다. 틈새 세포의 적절한 환경 조건을 유지하는 것은 오작동, 스트레스, 세포 주기 정지 또는 세포 사멸을 방지하는 데 필수적입니다. 이 연구의 조건에서 GSC는 촬영하는 동안 12시간 이상 지나도 조직 건강을 나타내는 중요한 단계인 유사분열에 들어갈 수 있습니다. 따라서 우리는 배양된 게르마리아가 대부분의 이미징 시간 동안 무결성과 기능을 유지한다고 추측합니다. 유사하게, 세포 주기 전반에 걸쳐 GFP:Par-1 물질의 새로운 생산(Villa-Fombuena et al. 2021 참조)8 때문에 이미지 획득을 10분마다 한 번만 줄이기 때문에 영화의 끝에 가까운 시점조차도 분석을 허용할 만큼 충분한 신호를 유지합니다. 어쨌든, 샘플 표백은 표백제 보정(13)과 같은 플러그인에 의해 잠재적으로 보정될 수 있다.
생 체 외에서 적절한 환경을 모방하기 위해 특정 보충제와 함께 촬영하는 동안 특정 시간 동안 슈나이더의 배지를 사용하여 곤충 조직을 유지할 수 있습니다. 중요한 것은 이 프로토콜이 FBS 이외의 성장 인자나 파리 추출물을 사용하지 않는다는 것입니다. 이전 연구에서는 많은 GSC가 일반적으로 G2에서 정지되고 높은 인슐린 수치에 의해 M 단계로 진입하는 것으로 나타났습니다.25. 따라서 우리는 GSC 세포 주기의 이러한 비정상적인 자극을 피하기 위해 배양 조건에 인슐린을 첨가하지 않습니다. 해부 배지에 FBS를 첨가하면 난소 이식 중에 계란 챔버가 피펫 팁 또는 유리 접시에 달라붙을 가능성을 줄일 수 있습니다21. 마지막으로, 항생제의 사용은 박테리아 및/또는 곰팡이 증식을 피하기 위해 장시간 영화에 적합합니다. 배양 접시에서 미생물의 과증식은 조직의 항상성을 변화시켜 세포 분열에 영향을 미칠 수 있습니다. 이 프로토콜에서 배지는 항생제의 혼합물을 포함합니다(일반적으로 1%(100U/mL 페니실린 및 100μg/mL 스트렙토마이신)로 보충됨). 마찬가지로, 긴 배양은 항생제의 효율성에 영향을 미칠 수 있으며 항생제 부패를 방지하기 위해 배지 교체를 고려할 수 있습니다.
초파리 게르마리아는 이 조직의 전형적인 연동, 회전 및 수축 운동을 방지하기 위해 제거해야 하는 관형 근육초로 둘러싸여 있습니다29,30. 따라서 이 근육초를 제거하면 리포터 신호의 관찰이 향상되고 공초점 설정 구성을 사용하여 신호 표백 및 광손상을 최소화할 수 있으며 고시간 해상도 이미지를 가능하게 합니다. 단점으로는 조직의 항상성에 대한 근육초의 기여도는 아직 알려지지 않았습니다. 따라서 제거는 GSC 틈새의 정상적인 기능에 어떤 식으로든 영향을 미칠 수 있습니다. 이 시스템의 또 다른 단점은 게르마리아가 촬영 중에 접착제에서 분리되어 주변 매체에서 표류할 수 있다는 것입니다. 따라서 이미지는 시점 내에서 또는 주어진 z-시리즈를 획득하는 동안에도 이동할 수 있습니다. 이 경우 등록 방법12와 같은 다른 플러그인을 사용하여 ImageJ에서 샘플 이동을 수정할 수 있습니다.
요약하자면, 우리는 라이브 게르마리아의 확장 영화를 획득하는 방법을 고안했습니다. 이 방법을 통해 GSC 세포 주기에 대한 자세한 정의와 분광체의 역학이 GSC 세포 주기의 다른 단계와 어떻게 상관관계가 있는지를 알 수 있었지만 프로토콜에 내재된 몇 가지 제한 사항을 알고 있습니다. 무엇보다도 이미지 획득은 환경 조건이 생체 내 조건을 정확하게 요약하지 않는 인공 매질에서 이루어집니다. 그러나 고정 조직을 사용하여 다른 저자가 보고한 것과 다른 세포 주기 단계 동안 분광체 형태에 관하여 유사한 결과를 얻었기 때문에31, 우리는 이 프로토콜이 생체 내 조건을 대체로 요약한다고 믿습니다. 둘째, 조직 무결성과 기능은 16시간 길이의 배양에 영향을 받지 않는 것처럼 보이지만 이를 신중하게 평가하지 않았습니다. 이상적으로는 촬영된 게르마리아를 암컷 복부에 다시 이식하고 대조군 게르마리아가 하는 것처럼 새로운 난실을 생성할 수 있는지 여부를 평가할 수 있습니다32. 이 연구에 사용된 라이브 이미징 방법은 특히 일반적으로 초파리 난소 생물학에서 GSC 비대칭 분열을 분석하는 데 유용한 도구입니다. 또한 이 접근법은 화합물, 성장 인자 또는 영양소가 배양 배지에 직접 보충될 수 있으므로 약리학적 연구에 특히 적합합니다. 또한 실험 샘플과 대조 샘플을 동일한 플레이트에 배치하여 실험 내 기술적 변화를 최소화할 수 있습니다.

생물학적 과정의 실시간 이미징은 직접적인 실험적 증거를 얻는 데 중요한 역할을 합니다. 첨단 컨포칼 현미경 검사법과 방법론 최적화의 결합을 통해 여러 생물학적 사건을 매우 정밀하게 탐색할 수 있습니다. 조직 조작 및 해부, 시료 준비 및 보존, 현미경 수집 설정과 같은 프로토콜의 단계를 최적화하는 것은 얻은 결과의 신뢰성과 견고성을 극대화하는 데 매우 중요합니다. 여기에서는 특히 Drosophila melanogaster 난소에 초점을 맞춘 확장 이미징을 위해 샘플을 모니터링하는 프로토콜을 제시합니다. Drosophila melanogaster ovary는 광범위한 발달 과정의 분석을 위한 훌륭한 모델 시스템입니다. 다른 많은 것들 중에서도 초파리 Drosophila melanogaster의 이 생식 기관에는 매우 잘 정의된 성체 줄기 세포 틈새가 포함되어 있습니다. 이 GSC 틈새 시장은 성인기 동안 여성 배우자의 발달을 유지합니다. 초파리 난소는 약 18개의 난소로 구성되어 있으며, 난실은 게르마리움에서 발달합니다. 각 germarium의 끝에서 2-4 GSC는 주로 8-10 개의 세포의 말단 필라멘트, 5-8 개의 캡 세포의 로제트 및 2-3 개의 전방 에스코트 세포 ( 그림 1A)로 형성된 체세포 틈새에서 유지됩니다. 이 체세포 틈새 시장은 GSC에 줄기를 유지하고 증식을 제어하며 분화를 방지하기 위한 필수 신호와 물리적 지원을 제공합니다1,2,3,4,5.
GSC는 일반적으로 비대칭으로 분열하여 체세포 틈새와 딸세포인 낭세포(cystoblast, CB)와 접촉을 유지하는 새로운 줄기세포를 생성하며, 이 세포는 체세포 캡 세포와의 직접적인 접촉을 잃고 분화합니다. GSC 및 CB는 매우 역동적이고 세포질 소기관인 분광체를 포함하며, 주요 기능은 유사분열 동안 유사분열 방추체의 올바른 방향6입니다. CB는 불완전 사이토카인시스(incomplete cytokinesis)로 4번 분열하여 16세포 낭종을 발생시키며, 생식세포 중 하나는 난모세포로 지정되고 다른 15개 세포는 간호사 세포가 됩니다. CB 분광체는 16개의 세포가 상호 연결된 생식세포 세포를 연결하는 fusome이라고 하는 분지 구조로 성장합니다. 분광체는 serine-threonine kinase Par-1 및 막 구성 요소인 Hu-li tai shao (Hts)7과 같은 작은 소포 및 골격 단백질이 풍부합니다. GSC 세포주기 동안 분광체는 새로운 물질이 추가되어 성장하고 모양이 변경되어 G1, S, G2 및 M 상을 식별 할 수 있습니다 (그림 1B) 8,9.
우리는 최근 최대 16시간 동안 살아있는 GSC를 이미징할 수 있는 Drosophila germarium의 생체 외 배양 방법을 구현했습니다. 이러한 세포는 평균 15.5시간마다 한 번씩 분열하기 때문에8, 이 방법을 사용하면 GSC 세포 주기의 많은 부분을 촬영할 수 있습니다. 따라서 다른 도구와 함께 당사의 배양 방법을 통해 GSC 세포주기 동안 분광체 형태를 설명하고 생체 내에서 다른 세포주기 단계의 지속 시간을 분석 할 수있었습니다 8 ( 그림 1C). 여기에서는 방법론을 설명하는 단계별 안내 비디오에서 지원하는 이 확장된 라이브 이미징 방법에 대한 자세한 프로토콜을 제공합니다(그림 2).

<table><tbody><tr><td>9웰 유리판</td><td>Corning&nbsp;</td><td>7220-85</td><td>n / a</td></tr><tr><td>염화칼슘 이수화물</td><td>시그마 Aldrich</td><td>C3881</td><td>CaCl2&middot; 2H2O; Ringer의 용액</td></tr><tr><td>Cell-Tak</td><td>Corning을 준비하려면&nbsp;</td><td>354240</td><td>세포 및 조직 접착제는 플라스틱, 유리, 금속, FEP 폴리머 및 생물학적 재료를 포함한 다양한 유형의 표면에 세포 또는 조직 절편을 부착하는 데 사용됩니다.</td></tr><tr><td>Dumont #5 펜치&nbsp;</td><td>파인사이언</td>스 <td>11252-20</td><td>n/a</td></tr><tr><td>Dumont #55 펜치&nbsp;</td><td>파인사이언</td>스 <td>11255-20</td><td>크기 0.05 mm x 0.02 mm 및 길이 11 cm</td></tr><tr><td>태아 소 세럼</td><td>Gibco</td><td>10500-064</td><td>인증, 열 비활성화, 유럽 승인, 남미 원산지&nbsp;</td></tr><tr><td>유리 바닥 접시</td><td>MatTek</td><td>P35GC-1.5-10-C</td><td>35 mm 접시, No. 1.5 커버슬립, 10 mm 유리 지름,&nbsp; Poly-D-Lysine 코팅</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H4034</td><td>Ringer의 용액</td></tr> 염화마그네슘을 준비하려면<tr><td>&nbsp;</td><td>시그마 알드리치</td><td>M1028</td><td>MgCl2; Ringer's 용액을 준비하기</td></tr><tr><td>위해 바늘 홀더</td><td>Roboz&nbsp;</td><td>RS-6061</td><td>경량, 중공 스테인리스 스틸 핸들, 4 3/4" 길이.</td></tr><tr><td>니콘 SMZ18 쌍안경&nbsp;</td><td>니콘</td><td></td><td>https://www.microscope. healthcare.nikon.com/products/stereomicroscopes-macroscopes/smz25-smz18</td></tr><tr><td>페니실린-스트렙토마이신</td><td>써모 피셔 사이언티픽</td><td>15140122</td><td>10,000 U/mL</td></tr><tr><td>염화칼</td>륨 <td>시그마 알드리치</td><td>P3911</td><td>KCl; Ringer's solution을 준비하기 위해</td></tr><tr><td>Schneider's Drosophila Medium</td><td>Biowest&nbsp;</td><td>L0207</td><td>곤충 세포용 세포 배양 배지</td></tr><tr><td>중탄산나트륨</td><td>시그마 알드리치</td><td>S8875&nbsp;</td><td>NaHCO3; &ge; 99.5 %, 분말</td></tr><tr><td>염화나트륨</td><td>시그마 Aldrich</td><td>S9888</td><td>NaCl; Ringer의 용액을 준비하기 위해</td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S9378</td><td>&ge; 99.5%(GC); Ringer's solution을 준비하기 위해</td></tr><tr><td>텅스텐 해부 바늘</td><td>Roboz&nbsp;</td><td>RS-6064</td><td>0.25mm, 초미세, 1미크론 팁(Pk 10)</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9416</td><td>분자 생물학, 점성 액체</td></tr><tr><td>효모 분말</td><td>Sigma Aldrich</td><td>51475</td><td>n/a</td></tr></tbody></table>

여성 drosophila melanogaster 생식세포 줄기세포 틈새의 확장된 라이브 이미징

Extended Live Imaging of Female Drosophila melanogaster Germline Stem Cell Niches

라이브 이미징 방법을 사용하면 동적 세포 과정을 실시간으로 자세히 분석할 수 있습니다. 초파리 난소는 시간이 지남에 따라 세포 분열, 줄기성, 분화, 이주, 세포사멸, 자가포식, 세포 접착 등과 같은 수많은 발달 과정의 역학을 탐구할 수 있는 훌륭한 모델입니다. 최근에는 암컷 초파리 GSC 틈새 시장에 대한 확장된 체외 배양 및 라이브 이미징을 구현했습니다. GFP::P ar-1 전이유전자를 보유한 초파리 계통을 예로 들면, 이 방법을 사용하면 GSC의 틈새 내에서 GSC의 비대칭 분열을 시각화하고 세포 주기에 따른 분광 형태의 변화를 설명할 수 있습니다. 여기에서는 Drosophila germaria의 생체 외 배양에 대한 자세한 프로토콜을 제시하여 암컷 GSC 틈새를 장기간 시각화할 수 있습니다. 중요한 것은 이 프로토콜이 스톡 센터 및/또는 초파리 연구 커뮤니티에서 사용할 수 있는 여러 형광 표지 관심 단백질이 있는 라이브 이미징 GSC에 광범위하게 적용할 수 있다는 것입니다.

이 확장된 라이브 이미징 프로토콜을 통해, 우리는 뚜렷한 생물학적 교란 없이 니치 내부에서 암컷 GSC의 비대칭 유사분열을 기록할 수 있습니다. 이를 위해 GFP::Par-1 단백질이 편재적으로 발현되는 생식샘(germaria)을 사용하며, 이 단백질은 GSC 세포 주기 동안 다섯 가지의 뚜렷한 스펙트로솜(spectrosome) 형태인 Round, Plug, Bar, Fusing, 그리고 Exclamation point를 구분해 줍니다(그림 1B,C). 더 자세한 설명으로는, Round-G2 스펙트로솜의 강한 GFP:Par1 신호(그림 1C, 패널 a)가 G2-M-G1 단계 동안 급격히 감소하는 것을 관찰했습니다. 중요한 점은, 이 형질전환 라인을 사용함으로써 GSC의 유사분열 진입을 시각화할 수 있다는 것인데, 이는 초기 전기(prophase) 동안 대부분의 GFP::Par-1이 스펙트로솜을 벗어나 세포질을 채우기 때문입니다(그림 1C, 패널 b). 또한, 세포질의 GFP::Par-1은 핵막 투과(nuclear envelope permeation, NEP) 단계를 정확하게 검출할 수 있게 해주는데8,14, 바로 이 순간에 GFP 신호가 핵질로 들어가기 때문입니다(그림 1C, 패널 b). 유사분열과 핵막 재형성 이후, GFP:Par1 신호는 Round-G1 스펙트로솜에서 점차 회복됩니다(그림 1C, 패널 c). Round-G1 스펙트로솜에 GFP:Par1 물질이 De novo로 추가되면서 Plug(그림 1C, 패널 d), Bar(그림 1C, 패널 e), 그리고 Fusing(그림 1C, 패널 f) 스펙트로솜 형태의 형성이 촉진됩니다. 마지막으로, GFP:Par1 마커는 수축성 액토미오신 링(actomyosin ring) 외에도 세포질 분열 중에 형성되는 미세소관이 풍부한 단백질 구조체인 midbody가 형성됨에 따라 Exclamation point 스펙트로솜을 시각화할 수 있게 합니다(그림 1C, 패널 e).
<img alt="생식선 줄기세포 분화 단계; spectrosome 형태; 주기 단계 도식; 현미경 이미지." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67389/67389fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="그림 1"> 
그림 1: 생존 GSC 내 spectrosome 주기 역학.(A) 말단 필라멘트 세포(TFCs, 청색), 전이 세포(TC, 적색), 캡 세포(CpCs, 보라색) 및 호송 세포(ECs, 회색)로 구성된 생식선 줄기세포(GSC) 틈새(niche)의 모식도. GSC(황색)는 spectrosome(녹색)이라 불리는 특징적인 소기관을 포함한다. GSC 세포 주기 동안 spectrosome은 구형에서 길쭉한 형태로, 다시 구형으로 순환한다. GSC는 분열하여 딸세포인 낭모세포(CB, 오렌지색)를 생성하며, CB는 틈새와의 접촉을 잃고 구형의 spectrosome을 포함한다. CB는 불완전한 세포질 분열과 함께 연속적으로 4회 동시 분열하여 fusome으로 연결된 2, 4, 8 및 16세포 낭(cyst)을 형성한다. (B) 세포 주기 동안 생성되는 다양한 spectrosome 형태를 나타내는 도식. (B') spectrosome 형태 관찰 예상 시간. (C) GSC 틈새에서 GFP::Par-1 신호를 보여주는 17시간 길이의 영상 타임포인트 이미지. 0분(0') 시점은 핵막 투과화(NEP)에 해당한다. 패널은 다섯 가지 서로 다른 spectrosome 형태(흰색 및 녹색 화살표 머리)를 보여준다: 원형(G2 및 G1 모두; 패널 a 및 c), 플러그형(패널 d), 바형(패널 e), 융합형(패널 f), 느낌표형(패널 e, 녹색 화살표 머리). 마지막 spectrosome 형태는 70분에 표시된 두 번째 GSC(녹색 점선)에 해당한다. GSC는 황색 및 녹색 점선으로 표시되어 있다. GSC 분열 후 생성된 CB는 오렌지색 점선으로 표시되어 있다. 스케일 바: 10 µm. 패널 A와 B는 Villa-Fombuena 외(8)의 허가를 받아 수정되었다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67389/67389fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="초파리 난소 소관 분리 도식; 단계: MatTek 준비, 해부, 이미징; 생물학적 방법." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67389/67389fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="그림 2"> 
그림 2: Drosophila 생식소의 장시간 라이브 이미징을 위한 Cell-Tak 접착제 마운팅 방법. (1) 접착제가 도포된 글라스 바닥 배양 접시를 준비하는 단계별 과정. (2) Ringer 용액 내에서의 Drosophila 난소 해부 및 개별 근육 제거 난소 소관 준비 개요. (3) 근육초가 제거된 난소 소관을 글라스 바닥 배양 접시로 옮김. (4) 글라스 바닥 배양 접시에 보충된 Schneider 배지를 채움. (5) 도립 공초점 현미경을 사용하여 10 h에서 16 h 동안 생식소를 이미징함. 이 그림은 Villa-Fombuena 등의 허가를 받아 수정되었습니다8. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67389/67389fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 확대 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

여기에서는 초파리 난소 틈새 시장에서 생식세포 줄기세포(GSC)의 비대칭 분열에 대한 실시간 이미징을 수행하기 위한 자세한 프로토콜을 제공합니다. 우리는 분광 단백질 Par-1의 녹색 형광 단백질(GFP) 융합을 유비쿼터스하게 발현하는 형질전환 라인을 사용합니다.

여성 Drosophila melanogaster 생식세포 줄기세포 틈새의 확장된 라이브 이미징

Live imaging methods allow the analysis of dynamic cellular processes in detail and in real-time. The Drosophila ovary represents an excellent model to ...

extended-live-imaging-female-drosophila-melanogaster-germline-stem

Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

여기 GFP 태그 glial 세포와 결합하여 라이브 미세 분석을 사용하여 개발 Drosophila의 눈을 glial 세포의 마이 그 레이션을 검사하기 위해 프로토콜을 설명합니다.

Drosophila 아이 Imaginal 디스크에 Glial 세포 이미징 마이 그 레이션 라이브

Drosophila의 hemocytes은 개발 배아의 전체를 통해 분산. 이 프로토콜은 찬란 표시된 hemocytes와 배아를 사용하여 이러한 마이 그 레이션을 마운트 및 이미지하는 방법을 보여줍니다.

라이브 영상 Drosophila melanogaster 배아 Hemocyte 마이 그 레이션

개별 준비 Drosophila</em라이브 이미징을위한> 계란 회의소

개인의 GFP 태그 단백질 또는 autofluorescent 구조의 라이브 영상을위한...

에 GFP-라벨 단백질의 영상을 라​​이브<em&gt; Drosophila</em&gt; Oocytes

이 논문은 직접 번데기를 통해 이미지 세포 행동에 빠른 스캐닝 공 초점 현미경을 사용하는 방법을 보여줍니다. 그대로 번데기 경우를 떠남으로서,이 방법은 직접 공부하기 어려운 초파리 개발의 단계에서 관찰하고 역동적 인 세포 프로세스의 측정을 할 수 있습니다.

의 번데기 케이스를 통해서 영상<em&gt; 초파리</em

이 프로토콜은 그대로 애벌레 뇌의 맥락에서 라이브 세포 이미징을 수행하는 데 사용하는 효율적인 방법을 자세히 설명합니다. 라이브 세포 이미징 방식은 지속적으로 이전에 간과 된 메커니즘을 밝혀, 비대칭 신경 줄기 세포 분열의 연구뿐만 아니라 다른 신경 인성과 발달 과정에 대한 귀중한 있습니다.

의 라이브 영상<em&gt; 초파리</em&gt; 애벌레 Neuroblasts

이 프로토콜은 살아있는 초파리 번데기 눈 신경 상피를 이미징하는 효율적인 방법을 제시합니다. 이 방법은 조직의 움직임과 불균일한 토폴로지를 보상하고, 여러 GFP 태그가 지정된 접합 단백질을 사용하여 세포 경계의 시각화를 향상시키며, 쉽게 조립할 수 있는 이미징 장비를 사용합니다.

의 라이브 영상 초파리 번데기 눈

이 프로토콜은 장기적인 ex vivo 배양과 Drosophila imaginal disc의 라이브 영상에 대한 상세한 방법을 설명합니다. 눈 디스크의 10 시간의 라이브 영상에서 광 수용체의 분화 및 구강 내 회전을 보여줍니다. 이 프로토콜은 간단하며 값 비싼 설정이 필요하지 않습니다.

장기의 라이브 영상<em&gt; 초파리</em&gt; 아이 디스크

우리는 살아있는 초파리 난소 조직에는 상피 줄기 세포 계보의 세포내 pH를 이미징에 대 한 프로토콜을 제공 합니다. 유전자 변형 파리 양적 형광 이미징 사용 하 여 바이오 센서는 pH 바이오 센서, mCherry::pHluorin, 이미지를 표현 생성 하 고 표준 곡선, 생성 한 형광 강도 값을 pH 값으로 변환 하는 방법을 설명 합니다.

라이브 초파리 난소 조직에 여 포 줄기 세포 계보의 이미징 세포내 pH에 대 한 방법

여기서, 우리는 후기 배아 초파리 남성 생식선을 생생하게 이미지화하는 데 필요한 해부 프로토콜을 제공한다. 이 프로토콜은 정상적인 조건 하에서 또는 트랜스제닉 또는 약리학적 조작 후에 동적 세포 과정의 관찰을 허용할 것이다.

후기 배아 초파리 고나드의 해부와 라이브 이미징

여기에서 우리는 생리학적 조건에서 세포 및 세포 내 역학을 관찰하기 위해 Drosophila melanogaster 세 번째 instar 유충에서 살아있는 외식편 뇌를 준비, 해부, 장착 및 이미지화하는 워크플로에 대해 논의합니다.

Drosophila melanogaster Third Instar 애벌레 뇌의 생세포 이미징

배우세요 Drosophila melanogaster 난소 틈새에서 생식세포 줄기세포의 비대칭 분열을 GFP 융합 단백질을 이용한 라이브 이미징으로 관찰하는 방법을. 이 기법은 세포 주기 전체와 스펙트로솜 역학을 연구하는 데 필수적입니다.

여성 Drosophila melanogaster 생식세포 줄기세포 틈새의 확장된 라이브 이미징

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