여성 Drosophila melanogaster 생식세포 줄기세포 틈새의 확장된 라이브 이미징

우리는 세포의 줄기를 제어하는 새로운 세포 및 분자 메커니즘을 발견하는 데 관심이 있습니다. 우리의 주요 목표는 줄기세포가 틈새에서 분화를 피하는 방법을 해독하는 것입니다. 우리는 실험 조건에서 작업하고 있기 때문에 GSC가 생리적 행동을 받을 수 있도록 조직의 무결성을 보존하는 것이 필수적입니다.

당사의 프로토콜은 건강하고 기능적인 GSC 틈새 시장을 유지하여 생체 내에서와 같이 분열하는 GSC를 모니터링할 수 있습니다. 수명 연장 이미징을 사용하면 GSC의 전체 세포 주기와 분광 역학을 연구할 수 있습니다. 특히, 우리는 세포주기 전반에 걸친 분광 변화를 성공적으로 특성화했는데, 이는 이전에는 고정된 이미지나 더 짧은 이미징 기간으로는 달성하기 어려웠던 작업입니다.

역학에 영향을 주지 않고 주로 실험을 수행하는 방법을 알면 틈새 세포가 어떻게 의사 소통하는지 탐구할 수 있습니다. 우리는 줄기세포의 생물학에서 대사 효소인 mRNA 간의 직접적인 상호 작용에 의해 매개되는 유전자 발현 및 세포 대사의 조절 메커니즘을 연구하고자 합니다. 시작하려면 밀리리터당 10, 000 단위의 농도로 스트렙토마이신 페니실린 항생제 혼합물의 100마이크로리터 분취액을 준비합니다.

절차에 필요한 다른 모든 시약을 준비하고 적절하게 보관하십시오. 유비쿼터스 및 구성적으로 표현된 파 1을 표현하는 1-2일 된 파리를 수집하여 GFP에 융합하여 새로운 튜브에 주입합니다. 해부 전에 인큐베이터에서 섭씨 25도에서 이틀 동안 파리를 배양합니다.

35mm 폴리-D-라이신 코팅 플레이트의 커버 슬립 중앙에 특정 Cell-Tak 접착제를 3마이크로리터 방울 떨어뜨립니다. 즉시 pH 8의 0.1몰 중탄산나트륨과 동일한 부피의 접착제 방울 3마이크로리터에 추가합니다. 용액을 피펫과 혼합하십시오.

완전한 증발을 위해 접시를 덮개와 함께 실온에서 20분 동안 배양합니다. 그런 다음 접시를 섭씨 4도에서 밤새 보관하십시오. 다음날 플레이트를 해동한 후 접착층을 건드리거나 방해하지 않도록 6마이크로리터의 오토클레이브 순수로 조심스럽게 세 번 세척합니다.

물을 실온에서 5-10분 동안 완전히 증발시키십시오. 시작하려면 파리를 양식하고 코팅이 된 유리 바닥판을 준비하십시오. 그런 다음 3 개의 우물 해부 접시, 집게 및 해부 바늘을 70 % 에탄올로 청소합니다.

약 200마이크로리터의 링거 용액을 해부 접시의 3개 웰 각각에 추가합니다. 집게를 사용하여 흉부와 복부의 교차점에 있는 초파리 암컷을 잡습니다. 후복부에서 큐티클을 부드럽게 찢고 다시 당겨 난소를 드러냅니다.

난소를 절개한 후 다음 웰로 옮겨 조직 잔여물이나 박리로 인한 파편으로 인한 오염을 줄입니다. LED 조명이 있는 실체 현미경 아래에서 한 쌍의 미세한 집게를 사용하여 전체 난소를 고정하고 두 번째 쌍을 사용하여 후기 단계의 난자 챔버를 잡습니다. 근육초가 부러지고 뒤처질 때까지 부드럽게 스트레칭합니다.

겸자를 사용하여 15-20개의 근육초가 없는 난소를 200마이크로리터의 링거 배지가 들어 있는 세 번째 웰로 하나씩 옮깁니다. 난소가 팁 벽에 달라붙는 것을 방지하기 위해 200마이크로리터 팁을 0.1% Tween 20으로 미리 적십니다. 미리 적신 팁을 사용하여 근육초가 없는 난소를 포함하는 6마이크로리터의 링거 용액을 실온에서 준비된 접착판에 옮깁니다.

해부 바늘이나 집게를 사용하여 난소를 링거 방울 바닥까지 조심스럽게 눌러 접착 표면과 접촉하도록 합니다. 다음으로, 15% FBS 및 0.6% 스트렙토마이신 페니실린 항생제 혼합물이 보충된 3mL의 슈나이더 배지를 MatTek 플레이트에 추가합니다. 평평한 표면에 근육초가 없는 난소가 들어 있는 플레이트를 현미경 스테이션으로 운반합니다.

회전 디스크 현미경 또는 컨포칼 현미경의 63x 대물렌즈에 플레이트를 놓습니다. 샘플의 초점을 맞추고 각 게르마늄에 대한 중간 Z 평면을 선택합니다. 실험 매개변수를 구성하려면 캡처 유형을 3D 타임랩스로 설정합니다.

레이저 출력을 최대 70%로 조정합니다. 여기 파장을 488나노미터로 설정합니다. Z 스택 범위는 30마이크로미터이고 Z 스택 사이의 거리는 1.2마이크로미터입니다.

시간 지점 사이의 간격을 10분마다로 설정하고 기간을 17시간으로 설정합니다. 사용 가능한 경우 다중 위치 옵션을 사용하여 샘플의 XY를 재정의합니다. Z 스택이 이 위치의 중앙에 오도록 각 germarium의 중간에 있는 Z 평면을 선택하고 획득을 시작합니다.

Imaris 또는 Image J 소프트웨어를 사용하여 분광체 형태의 변화를 시각화하기 위해 시간별 및 Z축을 따라 이미지를 분석합니다. 동영상을 만들려면 각 시점에서 최상의 Z 평면을 수동으로 선택합니다. 라운드 G2 스펙트럼 영역의 강력한 GFP 파 1 신호는 G2 MG1 단계에서 크게 감소했습니다.

초기 prophase GFP 동안 par one은 분광체를 떠나 세포질을 채웠고, 생식계열 줄기세포가 유사분열로 진입했음을 나타냅니다. 유사 분열 및 핵 포락 개혁 후, GFP 파 1 신호는 원형 G1 스펙트럼 사이클에서 점차적으로 회복되었습니다. 둥근 G1 분광체에 GFP 파 1의 Denovo 판은 마개, 막대기 및 융합 분광체 형태학의 대형으로 이끌어 냈습니다.