마누카 꿀로 처리된 상처 유발 박테리아에서 생존 가능하지만 배양할 수 없는 세포를 정량화하기 위한 살아있는/죽은 염색

이 연구 프로젝트는 마누카 꿀이 박테리아 생리학에 미치는 영향을 조사하는 것을 목표로 합니다. 최근 연구는 마누카 꿀이 박테리아 생리학에 미치는 항균 효과에 대한 추가적인 통찰력을 제공했습니다. 우리의 예비 연구 결과에 따르면 마누카 꿀 박테리아는 항생제에 내성이 있고 생존 가능하지만 배양할 수 없는 휴면 상태에 들어가지만 기존 항생제로 치료된 박테리아보다 그 정도가 덜합니다.

본 연구의 바탕으로, 마누카 꿀과 기존 항생제 유도 VBNC의 발현 프로파일을 비교하는 것은 흥미로울 것입니다. 시작하려면 얼어붙은 박테리아 균주가 들어 있는 바이알을 예로 들어 보겠습니다. 각각을 순차적으로 열고 멸균 스틱을 사용하여 적절하게 표시된 Luria-Bertani 또는 LB 한천 플레이트에 소량의 냉동 박테리아를 긁어냅니다.

바이알 캡을 교체하고 재빨리 냉동실에 넣습니다. 박테리아 배양액을 섭씨 37도에서 18-24시간 동안 배양합니다. 다음 날, 혈청학 피펫을 사용하여 LB 육수 2ml를 두 개의 멸균 시험관에 옮깁니다.

분젠 버너 불꽃에서 접종 루프를 살균합니다. 그런 다음 LB 한천 플레이트에서 LB 육수가 들어 있는 적절하게 라벨링된 시험관으로 박테리아 1/4 루프를 옮깁니다. 시험관을 섭씨 37도에서 약 250RPM의 진탕 인큐베이터에서 18-24시간 동안 호기성 조건으로 배양합니다.

마누카 꿀 설정 및 박테리아의 항생제 처리를 위해 10 밀리리터의 박테리아 배양액을 10 밀리리터의 Mueller Hinton 육수에 첨가하여 10 밀리리터 당 약 10에서 6 번째 콜로니 형성 단위를 갖는 박테리아 배양의 1:1, 000 희석을 얻습니다. 희석된 배양액을 사용하여 각 박테리아 종에 대한 3개의 샘플, 처리되지 않은 대조군, 마누카 꿀 처리된 샘플 및 항생제 처리된 샘플을 준비합니다. 마누카 꿀과 항생제를 적절한 튜브에 넣는다.

0.1 밀리리터 및 0.5 밀리리터의 처리되지 않은 시료를 멸균 마이크로 원심분리 튜브로 옮겨 사용 가능한 플레이트 수를 확인하고 T에 대한 살아있는/죽은 염색이 0 샘플과 같습니다. 그런 다음 처리되지 않은 대조군, 마누카 꿀 처리 및 항생제 처리된 샘플을 섭씨 37도의 호기성 조건에서 250RPM의 진탕 인큐베이터에서 24시간 동안 배양합니다. LB 배지에서 처리되지 않은 샘플이 0인 T의 10배 연속 희석을 준비하여 실행 가능한 플레이트 수에 대한 셀 수 있는 수를 얻습니다.

희석된 각 시료 50마이크로리터를 LB 한천 플레이트의 절반에 펴 바릅니다. 24시간 동안 섭씨 37도의 호기성 조건에서 한천 플레이트를 배양합니다. 다음 날, 인큐베이터에서 LB 한천 플레이트를 제거합니다.

약 25 - 150개의 콜로니가 포함된 희석 플레이트를 식별하고 정확한 콜로니 수를 계산합니다. 콜로니 형성 단위 공식을 사용하여 밀리리터당 배양 가능한 세포의 수를 결정합니다. 3일째에 0.5ml의 0.85%염화나트륨을 0.5ml의 T에 추가하면 0.5ml의 미처리 생염색/사염색 대조군 샘플이 0개가 됩니다.

샘플당 1.5마이크로리터의 SYTO 9와 1.5마이크로리터의 프로피듐 요오드화물을 결합합니다. 그런 다음 각 샘플에 혼합물 3마이크로리터를 추가합니다. 섭씨 21도의 어두운 곳에서 15분 동안 샘플을 배양합니다.

6마이크로리터의 염색되고 부드럽게 혼합된 샘플을 일회용 혈구계로 옮기고 플루오레세인 이소티오시아네이트 또는 FITC 필터와 40X 대물 렌즈를 사용하여 형광 현미경으로 봅니다. 혈구계 그리드 선과 녹색 세포를 모두 보여주는 이미지를 캡처합니다. 샘플당 6개의 필드에 있는 녹색 셀을 세고, 볼륨당 녹색 셀의 수를 계산하기 위해 그리드 차원을 기록합니다.

마지막으로, 살아있는/죽은 염색을 사용하여 얻은 밀리리터당 생존 가능한 세포 수에서 생존 가능한 플레이트 수를 사용하여 얻은 밀리리터당 배양 가능한 세포 수를 빼서 생존 가능하지만 배양 할 수 없는 세포의 수를 계산합니다. 4일차에 인큐베이터에서 처리되지 않은 마누카 꿀 처리 및 항생제 처리된 박테리아 배양액을 제거한 후 각 샘플을 0.1ml 및 0.5ml씩 마이크로 원심분리 튜브에 수집하여 실행 가능한 플레이트 수와 살아있는/죽은 염색을 합니다. 이 그림은 S.aureus 및 P.aeruginosa 배양에 대한 생존 플레이트 수와 살아있는/죽은 염색을 사용하여 결정된 배양 가능한 세포와 생존 가능한 세포의 수를 보여줍니다.

그 결과, 처리되지 않은 배양액과 마누카 꿀 처리된 배양액에서 검출된 생존 세포와 배양 가능한 세포의 수가 유의한 차이가 없었음을 보여줍니다. 토브라마이신으로 처리된 S.aureus 배양물은 생존 세포보다 배양 가능한 세포가 적었지만 이 차이는 유의하지 않았습니다. 메로페넴을 처리한 녹농균(P.aeruginosa)만이 생존 세포에 비해 배양 가능한 세포가 통계적으로 유의미하게 감소한 것으로 나타났습니다.