아가로 오스 겔 기반 Microfluidic 장치를 사용 신경 줄기 세포의 운동성 평가

안녕하세요, 저는 케빈이 이겼습니다. 저는 코넬 대학교의 바이오유체 연구실에서 공학 석사 과정을 밟고 있는 학생입니다. 그리고 오늘 저는 EGF 표피 성장 인자(epidermal growth factor)가 모린(Maureen) 신경 줄기세포에 미치는 영향을 연구하기 위해 아그로스(agros) 기반의 미세유체 장치를 사용하는 것에 대해 이야기하려고 합니다.

이 장치는 기본적으로 각각 150미크론 너비의 3개의 미세유체 채널로 구성됩니다. EGF는 사이드 채널 중 하나로 펌핑되고 버퍼는 다른 사이드 채널로 펌핑됩니다. 기본적으로 중앙 채널을 가로지르는 정적 선형 화학적 구배를 설정합니다.

EGF 확산체는 어그로 겔을 통해 쉽게 확산되기 때문에 뉴런 줄기세포는 중앙 채널에 파종되고 이동 진행 상황을 현미경을 통해 모니터링됩니다. 따라서 장치는 기본적으로 튜브에 연결하기 위한 모든 입구와 출구가 있는 플렉시 유리 최상층으로 구성됩니다. 그리고 그 아래에는 4개의 패턴 장치가 있는 농업 젤 멤브레인이 있습니다.

이것은 PDMS 스페이서로 둘러싸여 있어 전체 장치 전체에 걸쳐 일정한 두께를 보장합니다. PDMS와 젤은 ect로 코팅된 유리 슬라이드에 조립됩니다. 이것은 세포가 유리 슬라이드에 부착되는 데 도움이 됩니다.

또한 스테인리스 강판을 사용하여 전체 장치를 장착하고 나사를 끼우고 장치를 끼웁니다. 야생형 세포주는 야생형 EGF 수용체를 과도하게 발현하기 위해 레트로바이러스 벡터로 transfection되었으며, 델타 세포주는 EGF 수용체의 돌연변이 버전으로 transfection되어 EGF 리간드 없이 구성적으로 활성화될 수 있습니다. 자, 먼저 마이크로 유체 장치의 조립 과정을 설명하겠습니다.

그래서 저는 먼저 마스터에서 실리콘 마이크로 채널의 릴리프 기능 주위에 PDMS 스페이서를 배치했습니다. 이제 0.3g의 아그로의 무게를 잴 것입니다. 이제 저는 10mil의 CO2 독립 미디어를 가져와 아그로에 추가하려고 합니다.

그리고 저는 아로스 파우더와 CO2 독립 매체를 섞기 위해 위아래로 피펫을 만들 것입니다. 이제 전자레인지를 사용할 준비가 되었습니다. 지금 보시다시피 아그로스는 이제 액화되었지만 아직 몇 개의 과립이 남아 있습니다.

나는 과립을 녹이고 기포를 제거하기 위해 이것을 빙빙 돌리려고 노력할 것입니다. 그래서 저는 용융된 아그로스를 실리콘 마스터의 릴리프 기능에 붓고 이제 멸균 유리 슬라이드를 PDMS 스페이서 위에 놓을 것입니다. 그리고 저는 어그로 젤에 있는 대부분의 기포를 강제로 빼내기 위해 비스듬히 놓았습니다.

그리고 나는 압력을 가했고 아그로스 껍질이 굳을 때까지 계속 압력을 가할 것입니다. 그래서 1-2 분 후에 굳어졌습니다. 이제 슬라이드에서 초과 아그로스를 제거하겠습니다.

다음 단계는 유리 슬라이드를 부드럽게 밀어내는 것이며 이 유리 슬라이드는 배치할 수 있습니다. 이제 패턴 aros를 이전에 피브로넥틴으로 코팅한 유리 슬라이드로 부드럽게 옮기려고 합니다. 저는 기본적으로 이 플라스틱 멸균 시트를 사용하여 PDMM MS 스페이서로 패턴 아그로스를 들어 올리고 채널이 있는 패턴 아그로스를 슬라이드 쪽으로 옮길 것입니다.

이제 이것이 유리 슬라이드에 단단히 고정되었으므로 플라스틱 매니폴드가 채널에 접근할 수 있도록 개별 저장소에 구멍을 뚫겠습니다. 작은 금속 구멍 펀처를 사용하여 이 작업을 수행하겠습니다. 이제 장치에 구멍을 뚫는 작업이 완료되었습니다.

마이크로 채널의 건조를 방지하기 위해 500마이크로리터의 CO2 독립 매체를 추가하고 이제 1-2분 동안 그대로 두겠습니다. 좋아, 1-2분 후에 여분의 매체를 배출하려고 시도하고 이제 패턴 아그로스에 구멍을 뚫은 구멍을 플렉시글라스 매니폴드의 입구 및 출구 구멍에 정렬합니다. 그리고 구멍이 정렬되면 단단히 눌러 멋진 밀봉을 형성합니다.

이제 플렉시 유리 매니폴드를 스테인리스 스틸 마운트 위에 놓고 나사를 사용하여 장치를 부드럽게 끼웁니다. 나사를 과도하게 조이면 채널이 찌그러지고 내부 패턴 Agros 젤이 슬롯팅되는 것을 방지하기 위해 나사를 시계 방향으로 배치하기 때문에 매우 주의합니다. 1mil의 미디어를 그리고 이 주사기를 사용하여 장치를 테스트하겠습니다.

보시다시피 저는 각 마이크로 채널에 유체를 주입하고 각 배출구에서 유체가 나오는지 찾고 있습니다. 그래서 지금 당장은 조립된 장치를 현미경의 환경 챔버에 넣었습니다. 이것은 섭씨 37도로 유지되므로 장치를 예열하고 세포를 시드해야 할 때 준비할

그리고 보시다시피, 저는 이미 두 개의 파라솔 펌프 튜브를 설정을 통해 나사산을 꿰었습니다. 그리고 저는 현재 실험을 준비하기 위해 PBS로 튜브를 세척하고 있습니다. 이제 튜빙을 설정하겠습니다.

파라솔 펌프 튜브를 이미 구멍이 뚫린 캡을 통해 끼울 것입니다. 그리고 각 튜브에는 튜브의 입구와 출구를 모두 식별할 수 있도록 특정 수의 노치가 있습니다. 따라서 4개의 노치가 있는 튜브는 밀당 10나노그램을 받게 됩니다.

이제 EGF 솔루션이 튜브를 장치에 부착합니다. 그래서 노치가 몇 개 있는지에 따라 각 장치에 연결하겠습니다. 따라서 그것은 그것이 채택하고있는 솔루션에 해당합니다.

이제 배출구 튜브를 연결합니다. 우리는 투명한 tigon 튜브를 사용하여 매체가 실제로 출구 튜브를 통해 흐르고 채널에 막힘이 없는지 확인합니다. 이제 파라솔 펌프스를 시작하겠습니다.

이제 세포를 중앙 채널에 파종하는 절차를 시작하겠습니다. 먼저 센서 채널에서 여분의 미디어를 제거하겠습니다. 이제 세포를 볼 수 있습니다.

세포는 이미 CO2 독립 배지에서 현탁 상태입니다. 그리고 저는 중앙 채널의 입구에 60석에 앉았고 배출구에 20마이크로리터에 앉았습니다. 그리고 바라건대 세포가 중력에 의한 흐름에 의해 안착 될 것입니다.

그리고 다른 두 개의 민감한 채널에 대해 이 절차를 반복하고 이제 현미경으로 이를 관찰하여 세포가 성공적으로 장착되었는지 확인할 것입니다. 이제 세포는 유리 슬라이드에 달라붙었고 몇 분 안에 퍼지기 시작하여 고유한 형태를 얻기 시작할 것입니다. 그래서 오늘 우리는 실제 장치의 조립, 시약 준비 및 장치 내 세포 이동을 이미지화하는 데 사용하는 현미경 기술에 대해 다루었습니다.

결론적으로, 우리는 이 장치가 특히 임상 환경에서 훨씬 더 광범위한 폐기를 갖기를 희망합니다. 그래서 하나를 수평으로 그리십시오. C 17.2 세포의 궤적과 EGF 농도가 수직으로 증가하는 것을 보여줍니다.

이는 동일한 EGF 농도로 실험에 사용한 C 17.2 세포의 다양한 균주의 궤적을 보여줍니다. 모세포 데이터는 밀 EGF 농도 구배당 10나노그램에서 운동성이 최고조에 달한다는 것을 보여주며, 이는 수용체가 더 높은 EGF 농도에서 리간드로 포화 상태가 되었음을 나타냅니다. 그리고 야생형 데이터는 밀당 100나노그램 농도 또는 EGF에서 운동성이 증가한다는 것을 보여줍니다.

이는 수용체가 더 높은 EGF 농도에서 포화되지 않음을 나타냅니다. 이는 EGF 수용체를 과도하게 발현하도록 설계되었기 때문에 의미가 있습니다. 마지막으로, 델타 세포주 데이터는 세포의 운동성이 EGF 농도와 거의 무관하다는 것을 나타냅니다.

이는 또한 돌연변이된 EGF 수용체가 EGF의 존재와 독립적으로 활성화되도록 설계되었기 때문에 예상할 수 있습니다.