Name: 죽상동맥경화증에서 대동맥 조직의 3차원 이미징 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-10-25T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 55 s
Description: 학습하세요 조직 투명화 및 3차원 이미징 기법을 이용하여 쥐 대동맥의 죽상동맥경화증 진행 과정에서 말초신경계와 혈관벽의 구조적 변화를 시각화하는 방법을. 이 기술은 심혈관 질환의 세포-조직 상호작용 이해에 활용됩니다.

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<meta charset="utf8"></head><body>쥐 대동맥의 3D 이미징을 위해 최적화된 조직 제거 프로토콜

<ol><li>Libby, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+changing+landscape+of+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The changing landscape of atherosclerosis.</a> Nature. 592 (7855), 524-533 (2021).</li>
<li>Mohanta, S., Yin, C., Weber, C., Hu, D., Habenicht, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aorta+atherosclerosis+lesion+analysis+in+hyperlipidemic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Bio+Protoc%22%5BJournal%5D)">Aorta atherosclerosis lesion analysis in hyperlipidemic mice.</a> Bio Protoc. 6 (11), e1833(2016).</li>
<li>Yin, C., Mohanta, S. K., Srikakulapu, P., Weber, C., Habenicht, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Artery+tertiary+lymphoid+organs%3A+Powerhouses+of+atherosclerosis+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Artery tertiary lymphoid organs: Powerhouses of atherosclerosis immunity.</a> Front Immunol. 7, 387(2016).</li>
<li>Mohanta, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Artery+tertiary+lymphoid+organs+contribute+to+innate+and+adaptive+immune+responses+in+advanced+mouse+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Artery tertiary lymphoid organs contribute to innate and adaptive immune responses in advanced mouse atherosclerosis.</a> Circ Res. 114 (11), 1772-1787 (2014).</li>
<li>Carmeliet, P., Tessier-Lavigne, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Common+mechanisms+of+nerve+and+blood+vessel+wiring%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Common mechanisms of nerve and blood vessel wiring.</a> Nature. 436 (7048), 193-200 (2005).</li>
<li>Mohanta, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroimmune+cardiovascular+interfaces+control+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Neuroimmune cardiovascular interfaces control atherosclerosis.</a> Nature. 605 (7908), 152-159 (2022).</li>
<li>Mohanta, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiovascular+brain+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Cardiovascular brain circuits.</a> Circ Res. 132 (11), 1546-1565 (2023).</li>
<li>Hu, D., Yin, C., Luo, S., Habenicht, A. J. R., Mohanta, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+smooth+muscle+cells+contribute+to+atherosclerosis+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Vascular smooth muscle cells contribute to atherosclerosis immunity.</a> Front Immunol. 10, 1101(2019).</li>
<li>Newland, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type-2+innate+lymphoid+cells+control+the+development+of+atherosclerosis+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Type-2 innate lymphoid cells control the development of atherosclerosis in mice.</a> Nat Commun. 8, 15781(2017).</li>
<li>Grabner, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphotoxin+beta+receptor+signaling+promotes+tertiary+lymphoid+organogenesis+in+the+aorta+adventitia+of+aged+Apoe-%2F-+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Lymphotoxin beta receptor signaling promotes tertiary lymphoid organogenesis in the aorta adventitia of aged Apoe-/- mice.</a> J Exp Med. 206 (1), 233-248 (2009).</li>
<li>Mai, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-body+cellular+mapping+in+mouse+using+standard+igg+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Whole-body cellular mapping in mouse using standard igg antibodies.</a> Nat Biotechnol. 42 (4), 617-627 (2024).</li>
<li>Molbay, M., Kolabas, Z. I., Todorov, M. I., Ohn, T. L., Erturk, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+guidebook+for+disco+tissue+clearing%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Syst+Biol%22%5BJournal%5D)">A guidebook for disco tissue clearing.</a> Mol Syst Biol. 17 (3), e9807(2021).</li>
<li>Tainaka, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-body+imaging+with+single-cell+resolution+by+tissue+decolorization%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Whole-body imaging with single-cell resolution by tissue decolorization.</a> Cell. 159 (4), 911-924 (2014).</li>
<li>Tian, T., Yang, Z., Li, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+clearing+technique%3A+Recent+progress+and+biomedical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22J+Anat%22%5BJournal%5D)">Tissue clearing technique: Recent progress and biomedical applications.</a> J Anat. 238 (2), 489-507 (2021).</li>
<li>Adolfs, Y., Raj, D. D. A., Brignani, S., Pasterkamp, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocol+for+tissue+clearing+and+3d+analysis+of+dopamine+neurons+in+the+developing+mouse+midbrain%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protoc%22%5BJournal%5D)">Protocol for tissue clearing and 3d analysis of dopamine neurons in the developing mouse midbrain.</a> STAR Protoc. 2 (3), 100669(2021).</li>
<li>Power, R. M., Huisken, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+guide+to+light-sheet+fluorescence+microscopy+for+multiscale+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">A guide to light-sheet fluorescence microscopy for multiscale imaging.</a> Nat Methods. 14 (4), 360-373 (2017).</li>
<li>Sun, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+clearing+approaches+in+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Tissue clearing approaches in atherosclerosis.</a> Methods Mol Biol. 2419, 747-763 (2022).</li>
<li>Chistiakov, D. A., Ashwell, K. W., Orekhov, A. N., Bobryshev, Y. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innervation+of+the+arterial+wall+and+its+modification+in+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Auton+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Innervation of the arterial wall and its modification in atherosclerosis.</a> Auton Neurosci. 193, 7-11 (2015).</li>
<li>Cao, Y., Wang, H., Wang, Q., Han, X., Zeng, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+volume+fluorescence-imaging+of+vascular+plasticity+in+adipose+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Metab%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional volume fluorescence-imaging of vascular plasticity in adipose tissues.</a> Mol Metab. 14, 71-81 (2018).</li>
<li>Kirst, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+the+fine-scale+organization+and+plasticity+of+the+brain+vasculature%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Mapping the fine-scale organization and plasticity of the brain vasculature.</a> Cell. 180 (4), 780-795.e25 (2020).</li>
<li>Todorov, M. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Machine+learning+analysis+of+whole+mouse+brain+vasculature%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Machine learning analysis of whole mouse brain vasculature.</a> Nat Methods. 17 (4), 442-449 (2020).</li>
<li>Bhatia, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+proteomics+in+three-dimensional+intact+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Spatial proteomics in three-dimensional intact specimens.</a> Cell. 185 (26), 5040-5058.e19 (2022).</li>
<li>Mai, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scalable+tissue+labeling+and+clearing+of+intact+human+organs%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Scalable tissue labeling and clearing of intact human organs.</a> Nat Protoc. 17 (10), 2188-2215 (2022).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>2,2'-티오디에탄올 (TDE)</td><td>시그마&nbsp;</td><td>166782</td><td>맑게 하는 시약</td></tr><tr><td>Amira</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>3D 시각화 소프트웨어; 3D 이미지에서 수동 분할 및 추적에 사용되는 이미지 처리 소프트웨어</td></tr><tr><td>벤질 알코올</td><td>시그마&nbsp;</td><td>W213713</td><td>청산 시약</td></tr><tr><td>벤질 벤조에이</td>트 <td>시그마</td><td>B6630</td><td>청산 시약</td></tr><tr><td>CD16/32</td><td>eBioscience</td><td>14-0161-82</td><td>차단 용액</td></tr><tr><td>컨포칼 레이저 스캐닝 현미경&nbsp;</td><td>Leica Microsystems</td><td>TCS-SP8 3X</td><td>이미징 장치는 세포 내 해상도에서 특이성이 높은 온전한 생물학적 조직 또는 절편의 다차원 고해상도 이미징을 위한 장치입니다.</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>D3571</td><td>핵 마커</td></tr><tr><td>디클로로메탄(DCM)</td><td>시그마&nbsp;</td><td>270997</td><td>청산 시약</td></tr><tr><td>해부 팬-블랙 왁스&nbsp;</td><td>써모 사이언티픽&nbsp;</td><td>S17432</td><td>대동맥 박리 및 고정&nbsp;</td></tr><tr><td>해부 실체현미경</td><td>Leica Microsystems&nbsp;</td><td>Stemi 2000</td><td>쥐 장기 해부</td></tr><tr><td>에탄올&nbsp;</td><td>시그마</td><td>E7023</td><td>탈북&nbsp;</td></tr><tr><td>에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)</td><td>로스&nbsp;</td><td>8040.1</td><td>관류 완충액&nbsp;</td></tr><tr><td>피지&nbsp;</td><td>(ImageJ, NIH)</td><td></td><td>2D 및 3D 이미지를 위한 오픈 소스 이미지 처리 소프트웨어</td></tr><tr><td>염소 안티-햄스터 IgG, Cy3</td><td>Dianova&nbsp;</td><td>127-165-099</td><td>2차 항체</td></tr><tr><td>염소 항-토끼 IgG, Alexa Fluor 680</td><td>Thermo Fisher Scientific / Invitrogen</td><td>A-21109</td><td>2차 항체&nbsp;</td></tr><tr><td>염소 항-쥐 IgG, Cy5</td><td>Dianova</td><td>712-175-150</td><td>2차 항체</td></tr><tr><td>햄스터 항-CD3e&nbsp;</td><td>BD 바이오사이언스</td><td>145-2C11&nbsp;</td><td>Pan-T 세포 마커</td></tr><tr><td>Huygens Professional</td><td>Scientific Volume Imaging, 네덜란드</td><td>버전 19.10</td><td>이미지 복원 소프트웨어; 주로 2D 및 3D 이미지의 디콘볼루션에 사용되는 이미지 처리 소프트웨어</td></tr><tr><td>이미지 처리 워크스테이션</td><td>MIFCOM&nbsp;</td><td>공초점, 다광자 및 광시트 현미경으로 획득한 이미지의 후처리를 위한 Leica 애플리케이션 제품군 X, Fiji 및 Imaris를 포함한 모든 이미지 처리 소프트웨어가 장착된</td> <td>MIFCOM X5</td> 이미지 처리 워크스테이션</tr><tr><td>Imaris</td><td>Bitplane</td><td>버전 8.4</td><td>이미지 분석 소프트웨어; 3D 이미지의 자동 분할에 사용되는 이미지 처리 소프트웨어</td></tr><tr><td>인큐베이터 및 로테이터&nbsp;</td><td>마샬 사이언티픽&nbsp;</td><td>Innova 4230</td><td>조직 세척 중 배양 및 회전 장치&nbsp;</td></tr><tr><td>iSpacer</td><td>Sunjin Lab</td><td>IS4020</td><td>직사각형 우물 샘플 홀더</td></tr><tr><td>Ketamine</td><td>Livisto</td><td></td><td>마취</td></tr><tr><td>Leica 응용 프로그램 제품군 X (LAS-X)&nbsp;</td><td>Leica Microsystems</td><td>버전 3.5</td><td>Leica 현미경으로 획득한 이미지를 위한 이미지 처리 소프트웨어</td></tr><tr><td>광학 현미경</td><td>Leica Microsystems</td><td>DM LB</td><td>밝은 파일 이미징을 위한 이미징 장치</td></tr><tr><td>라이트 시트&nbsp; 현미경</td><td>LaVision BioTech</td><td>Ultramicroscope II</td><td>얇은 광학 절편의 이미지를 빠르게 획득하여 낮은 광 노출로 대형 생물학적 표본 또는 전체 마우스의 빠른 고해상도 이미징을 위한 이미징 기술입니다.</td></tr><tr><td>다광자 현미경 Leica</td><td>Microsystems</td><td>TCS-SP5II MP&nbsp;</td><td>장기간에 걸쳐 세포 내 및 분자 수준에서 온전하고 생존 가능한 생물학적 조직을 최소한의 침입으로 샘플 깊숙이 다차원적으로 고해상도로 이미징하기 위한 이미징 방식</td></tr>.<tr><td>일반 염소 혈청&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>G9023</td><td>블로킹 솔루션</td></tr><tr><td>파라포름알데히드(PFA)&nbsp;</td><td>시그마&nbsp;</td><td>P-6148&nbsp;</td><td>고정&nbsp;</td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수 (PBS)</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>P4417-100탭&nbsp;</td><td>세척 버퍼</td></tr><tr><td>돼지 피부 젤라틴</td><td>시그마&nbsp;</td><td>G1890</td><td>인큐베이션 버퍼</td></tr><tr><td>Quadrol</td><td>Sigma</td><td>122262</td><td>CUBIC 클리어링 시약</td></tr><tr><td>Rabbit Anti-NF200</td><td>Sigma</td><td>N4142</td><td>Pan-neuronal marker</td></tr><tr><td>Rat Anti-B220&nbsp;</td><td>BD Bioscience</td><td>RA3-6B2</td><td>Pan-B 세포 마커</td></tr><tr><td>설탕</td><td>시그마&nbsp;</td><td>90M003524V&nbsp;</td><td>탈수&nbsp;</td></tr><tr><td>Sytox</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>S11380</td><td>핵 마커</td></tr><tr><td>Tetrahydrofuran</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>401757</td><td>세척 시약&nbsp;</td></tr><tr><td>트리톤 X-100</td><td>로스&nbsp;</td><td>3051.1</td><td>침투</td></tr><tr><td>요소</td><td>시그마&nbsp;</td><td>U5128</td><td>큐빅 클리어링 시약</td></tr><tr><td>자일렌&nbsp;</td><td>피셔 케미컬&nbsp;</td><td>x/0250/17&nbsp;</td><td>마취제&nbsp;</td></tr></tbody></table>

죽상동맥경화증에서 대동맥 조직의 3차원 이미징

Three-Dimensional Imaging of Aortic Tissues in Atherosclerosis

손상되지 않은 건강한 대동맥과 병든 대동맥의 미세해부학적 구조를 입증하고 죽상동맥경화증의 마우스 모델에서 면역계, 신경계, 심혈관계의 물리적 연결성을 밝히기 위해 두 가지 상보적인 조직 정화 접근법, 즉 분리된 대동맥의 TDE 투명화와 전체 마우스의 iDISCO 투명화를 사용했습니다(그림 1). 전체 마운트 면역염색 후, 대 동맥은 일련의 TDE 작업 솔루션으로 제거되었습니다. RI는 최종 단계의 TDE 농도에 따라 1.4-1.5에서 일치하여 부피를 변경하지 않고 대동맥 조직의 최적 투명도를 달성합니다(그림 1A). TDE 투명화와 달리, iDISCO 투명화 프로토콜에는 전체 마운트 면역염색 전 탈색 및 투과화 단계가 포함되며, 그 다음에는 다양한 화학 용매를 사용한 탈립화 및 탈수, 1.56에서 RI 정합이 포함됩니다(그림 1B). iDISCO 클리어링을 사용하면 조직의 수축으로 인해 큰 조직과 전체 마우스 본체를 시각화할 수 있습니다.
TDE 투명 전체 마운트 en face 대동맥의 컨포칼 및 다광자 3D 이미징을 통해 다른 구조 중에서 내막 플라크, 외막 세포성 및 외막 신경 돌기를 포함한 구조를 시각화할 수 있는 반면, iDISCO 투명 마우스의 광시트 이미징을 통해 혈관 주위 지방 조직, 신장 림프절 및 신경 및 신경절을 포함한 관련 신경 구성 요소와 함께 동맥 나무를 시각화하고 복원할 수 있습니다(그림 1C)을 사용합니다. 예를 들어, TDE가 제거된 죽상경화성 대동맥의 컨포칼 이미징은 플라크에서 여러 CD3e 염색 T 세포를 검출하고 ATLO에서 서로 다른 직경의 NF200 염색 신경 섬유의 광범위한 신생을 감지한 반면, TDE의 다광자 이미징은 노화된 Apoe-/- 마우스에서 전체 마운트 질환 복부 대동맥을 제거함으로써 ATLO 내 B220 음성 T 세포 영역에서 NF200 발현 축삭돌기의 영역성을 보여주었습니다(그림 2A). 반대로, iDISCO의 광시트 이미징은 전체 생쥐 복부를 청소하여 대동맥과 인접한 교감신경절 사이의 공간적 관계를 시각화했습니다. 신경절에서 대동맥 표면까지의 개별 축삭돌기의 3D 이미지 분할 및 추적은 죽상동맥경화성 플라크에 인접한 대동맥 외막에서 새로 형성된 NF200 염색된 축삭돌기를 포함하여 강력한 신경 재구조화를 보여주었습니다(그림 2B).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67400/67400fig01.jpg"> 
그림 1: 연구의 작업 흐름. (A) en 직면 대동맥의 수성 기반 TDE 청소. (B) 전체 마우스의 솔벤트 기반 iDISCO 투명화. (C). 3D 광학적으로 투명화된 분리된 대동맥 또는 전체 마우스 샘플의 체적 이미징 및 이미지 처리. 이 그림은 Sun et al.17의 허가를 받아 수정되었습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67400/67400fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67400/67400fig02v2.jpg"> 
그림 2: TDE 및 iDISCO 투명화 조직의 3D 이미지 예.(A) TDE 투명화 대동맥의 3D 이미징. 상단 패널: 컨포칼 이미지는 내막 플라크에서 CD3e+ T 세포(빨간색, 화살표)와 죽상경화성 대동맥 외막증(ATLO)에서 NF200+ 신경 축삭돌기(녹색)를 보여주었습니다. 하단 패널: 다광자 이미지는 78주 된 수컷 Apoe-/- 마우스의 ATLO에서 NF200+ 신경 축삭돌기(녹색, 화살촉), B220+ B 세포(빨간색, 열린 삼각형), 콜라겐 유래 2차 조화 생성(SHG, 흰색)을 보여주었습니다. Sytox(파란색)와 DAPI(파란색)가 핵을 보여주었습니다. (B) iDISCO의 3D 재구성 및 분할 이미지는 전체 마우스 복부를 청소했습니다. NF200+ 신경 및 축삭돌기(화살표, 녹색)의 광시트 3D 재구성, 분할 및 추적과 온전한 복부 대동맥의 교감신경절(화살촉)과의 공간적 관계. 열린 삼각형은 죽상경화성 플라크에 인접한 새로 형성된 축삭돌기를 나타냅니다. 자가형광(auto)은 플라크(청록색) 및 신장 림프절(RLN, 파란색)을 포함한 대동맥 및 결합 조직을 이미지화하는 데 사용되었습니다. CG, 셀리악 신경절, SycG, 교감 사슬 신경절. 이 수치는 Mohanta et al.6 및 Sun et al.17의 허가를 받아 수정되었습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67400/67400fig02largev2.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

Recent research has advanced the understanding of atherosclerosis as a transmural chronic inflammatory disease involving all three layers of the arterial ...

three-dimensional-imaging-of-aortic-tissues-in-atherosclerosis

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

상패 생물학의 2 차원 분자 이미징을위한 intravascular 우리는 세부 새로운 가까운 적외선 형광 (NIRF)...

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