Name: Glycomics-guided glycoproteomics는 복잡한 종양 미세환경에서 당단백질체의 포괄적인 프로파일링을 용이하게 합니다. (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-02-07T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 59 s
Description: 배우세요 당단백질체학 기반 종양 미세환경에서 당단백질체의 포괄적 프로파일링 방법을. 이 기술은 질량분석 데이터 해석의 어려움을 극복하고 암 당생물학 연구에 정확한 통찰을 제공합니다.

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<meta charset="utf8"></head><body>Glycomics-Guided Glycoproteomics를 사용한 대장암 조직의 프로파일링

단백질 당화(glycosylation)는 계통발생학적 생명의 나무(phylogenetic tree of life) 1,2,3 전반에 걸쳐 종에 의해 생산되는 단백질의 일반적이고 복잡한 유형의 공동 및 번역 후 변형입니다. 단백질 결합 글라이칸은 세포 상호 작용 및 통신 이벤트의 중재 및 조절을 포함하여 인체 건강에 중요한 광범위한 생물학적 과정에 영향을 미치는 것으로 알려져 있습니다 4,5. 비정상적인 단백질 당화(glycosylation)는 악성 변형, 종양 진행 및 확산의 원인으로 생각되어 왔습니다 6,7,8. 이는 글라이칸이 종양 미세환경(TME)의 주요 종양 생성 과정에 관여한다는 것을 의미하며, 글라이칸 기반 바이오마커 및 치료 응용 분야의 발견을 위한 상당하고 미개척 잠재력을 제공합니다. 따라서 당생물학(glycobiology)은 암 연구와 생명과학 분야에서 점점 더 많은 관심을 받고 있다9.
지난10년 동안 당분석 및 정보학의 주요 발전에 힘입어 10,11,12,13,14,15,16,17, 액체 크로마토그래피-탠덤 질량 분석법(LC-MS/MS) 기반 글리코믹스 및 당단백질체학은 복잡한 혼합물에서 유리된 글라이칸 및 온전한 글리코펩타이드의 시스템 전체 프로파일링을 위한 강력한 도구로 확립되었습니다. 다양한 유형의 암 환자 표본 (예 : 종양 조직, 세포 집단, 체액)과 같은 생물학적 샘플 기원에서 직접 추출한 당 단백질 3 , 13 , 18 , 19 , 20 .
Glycomics는 세포, 조직, 심지어 전체 유기체에 의해 동적으로 생성되는 글리칸 레퍼토리(글리솜)의 구조와 양에 대한 정보를 제공합니다. 반면에, 당단백질체학(glycoproteomics)은 단백질 운반체 및 당화(glycosylation) 부위, 부위 점유율(거시 이질성), 부위 특이적 글라이칸 조성 및 부위 분포 패턴(미세이질성)에 대한 정량적 정보를 제한된 글라이칸 구조 정보(종종 글라이칸 조성으로 제한됨)와 함께 제공합니다15,16,21 . 따라서 글리코믹스(glycomics)와 글리코프로테오믹스(glycoproteomics)는 글리코프로테오메(glycoproteome)의 생화학적 세부 사항을 조사하기 위한 보완적인 접근 방식입니다22.
글리코믹스 및 글리코프로테오믹스에 대한 수많은 방법론적 설계 및 분석 전략이 개발되어 관심 있는 글리코분석물(예: N-/O-/C-연결, 글리칸/글리코펩타이드/당단백질, 라벨링/비라벨링), 샘플의 특성(예: 세포, 조직, 체액), 양(나노그램/마이크로그램/밀리그램 단백질 수준) 및 사용 가능한 분석 기기에 따라 실험실 전반에 걸쳐 적용되었습니다23, 24,25,26,27,28,29,30,31,32. 병행 사용의 알려진 이점에도 불구하고 글리코믹스 및 글리코프로테오믹스는 일반적으로 함께 적용되지 않고 분석 전문 지식과 전문 기기에 대한 높은 요구로 인해 글리코생물학 및 암 연구 연구에서 독립적인 접근 방식으로 사용됩니다.
이러한 기술적 격차를 인식한 우리는 10여 년 전에 복잡한 생물학적 표본에서 얻은 당체학 및 당단백질체학 데이터를 통합할 수 있는 당체학 보조 당단백질체학(glycomics-assisted glycoproteomics) 방법을 도입했습니다33. 요컨대, 글리코믹스 보조(또는 이 프로토콜에서와 같이 글리코믹스 유도) 글리코프로테오믹스 기술은 확립된 다공성 흑연화 탄소(PGC) LC-MS/MS 방법(34,35)을 통해 N- 및/또는 O-글리칸을 프로파일링한 다음, 글라이칸 검색 공간(36)의 경계를 정의하여 동일한 샘플(들)에서 획득한 온전한 N- 및/또는 O-글리코펩티드 데이터의 분석에 사용됩니다. PGC-LC-MS/MS는 높은 감도와 구조적 분해능으로 글리콤에 대한 정량적 통찰력을 제공하여 복잡한 혼합물 35,37,38 내에서도 글라이칸의 토폴로지(단당류 서열 및 분기 패턴) 및 글리코시드 결합에 대한 정보를 제공하기 때문에 특히 강력한 글리코믹스 방법입니다. 당단백질체학(glycoproteomics) 워크플로우에는 펩타이드 생성, 선택적 펩타이드 라벨링, 다중화 및 사전 분획뿐만 아니라 역상 LC-MS/MS 분석 전 농축이 포함되며, 이는 분석물 식별을 위해 단계적 충돌 에너지/고에너지 충돌 해리(sceHCD, N-글리코펩티드의 경우) 및 전자 전달/고에너지 충돌 해리(EThcD, O-글리코펩티드의 경우)를 포함한 다양한 단편화 방법을 이상적으로 사용합니다. N-글리코프로테옴 분석의 경우, 병렬 de-N-글리코프로테오믹스는 단백질/펩타이드 검색 공간을 정의하고 점유된 N-글리코실화 부위 및 부위 점유율에 대한 자세한 정보를 제공하여 온전한 N-글리코펩타이드 데이터 분석을 안내할 수 있으며, 비변형 펩타이드의 병렬 분석은 연구된 조건 간의 단백질 수준 변화를 보여줍니다.
이 백서는 글리코믹스 유도 당단백질체학(glycomics-guided glycoproteomics) 방법에 대한 상세하고 따르기 쉬운 단계별 프로토콜을 제공합니다(워크플로우 개요는 그림 1 참조). 이 프로토콜은 시료 전처리 단계와 LC-MS/MS 기반 당체학 및 당단백질체학 실험에 대한 실험적 세부 정보를 제공하고, 결장직장암(CRC) 환자에서 절제된 종양의 포르말린 고정 파라핀 포매(FFPE) 조직 절편에 이 방법을 적용하는 것을 보여주는 대표적인 결과를 제시하여 전 세계 암 바이오뱅크에 보관된 귀중한 샘플 유형에서 TME의 당생물학에 대한 통찰력을 제공합니다. 글리코믹스(glycomics) 및 글리코프로테오믹스(glycoproteomics) 데이터의 분석 및 통합도 간략하게 논의됩니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67405/67405fig01v2.jpg"> 
그림 1: 글리코믹스 유도 당단백질체학(glycomics-guided glycoproteomics) 방법의 개요. 개요는 글리코믹스(왼쪽) 및 당단백질체학(오른쪽) 워크플로우의 자세한 실험 단계를 보여주며, 얻은 정보에 대한 개요(굵게 표시)와 향상된 데이터 분석 및 해석을 통해 두 가지 접근 방식이 어떻게 통합되는지를 보여줍니다. 삽입: (i) 글리코믹스 및 (ii-iii) 글리코프로테오믹스 워크플로우에 사용되는 자체 제작 SPE 마이크로 컬럼. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67405/67405fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

<table><tbody><tr><td><강한>화학물질</강한></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>암모늄 아세테이트&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A1542</td><td>대안 사용 가능</td></tr><tr><td>중탄산 암모늄, 순도 &ge; 99.0%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A6141</td><td>대안 사용 가능</td></tr><tr><td>무수 아세토니트릴(ACN), LC-MS 등급</td><td>Sigma Aldrich</td><td>34851</td><td>대안 사용 가능</td></tr><tr><td>소 페투인</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F3004</td><td>대안 사용 가능</td></tr><tr><td>디티오트레이톨(DTT)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D0632</td><td>대안 사용 가능</td></tr><tr><td>에탄올</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E7023</td><td>대안 사용</td></tr> 가능 <tr><td>포름산, LC-MS 등급</td><td>Sigma Aldrich</td><td>00940</td><td>대안 사용</td></tr> 가능 <tr><td>빙초산</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A6283</td><td>대안 사용</td></tr><tr><td>가능 요오드아세트아미드(IAA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I1149</td><td>대안 사용 가능</td></tr><tr><td>메탄올</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M1775</td><td>대안 사용 가능</td></tr><tr><td>펩타이드-N-글리코시다아제 F (PNGase F)</td><td>Promega</td><td>V4831</td><td>Elizabethkingia miricola PNGase F (10 U/&mu; L) 대장균에서 재조합으로 발현됨;</td></tr><tr><td>폴리비닐피롤리돈 40 (PVP)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>PVP40</td><td>대안 사용 가능</td></tr><tr><td>수산화칼륨(KOH)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>484016</td><td>대안 사용 가능</td></tr><tr><td>시퀀싱 등급 돼지 트립신&nbsp;</td><td>Promega</td><td>V5113</td><td>대안 사용</td></tr> 가능 수<tr><td>소화붕소나트륨(NaBH4)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>213462</td><td>대안 사용 가능</td></tr><tr><td>트리에틸암모늄 바이카보네이트(TEAB), LC-MS 등급</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T7408</td><td>대안 사용</td></tr> 가능 <tr><td>트리플루오로아세트산(TFA), LC-MS 등급</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T6508</td><td>대안 사용 가능</td></tr><tr><td>Tools/Materials</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>C18 디스크</td><td>Empore</td><td>66883-U</td><td></td></tr><tr><td>C8 디스크</td><td>Empore</td><td>66882-U</td><td></td></tr><tr><td>Flat-bottom polypropylene 96-well plate&nbsp;</td><td>Corning</td><td>3364</td><td></td></tr><tr><td>Immobilon-PSQ 폴리비닐리덴 디플루오라이드 (PVDF) 막</td><td>Millipore</td><td>IPVH20200</td><td>기공 크기: 0.45 & 엠&nbsp;</td></tr><tr><td>Microcentrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5452000069</td><td>대안 사용 가능</td></tr><tr><td>Microcentrifuge 어댑터&nbsp;</td><td>The Nest Group, Inc., MA</td><td>SS18V</td><td>MiniSpin Column Collar는 Microspin</td></tr><tr><td>Columns Oligo R3 수지</td><td>Thermo</td><td>1133903</td><td>Particle size 30 &mu; m</td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Parafilm M</td><td>PM996</td><td></td></tr><tr><td>Protein LoBind 튜브 1.5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>0030108450</td><td></td></tr><tr><td>Protein LoBind 튜브 2.0 mL</td><td>Eppendorf</td><td>0030108442</td><td></td></tr><tr><td>Safe-lock 튜브 1.5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>0030120086</td><td></td></tr><tr><td>Safe-lock 튜브 2.0 mL</td><td>Eppendorf</td><td>0030120094</td><td></td></tr><tr><td>Shaker</td><td>Eppendorf</td><td>5382000066</td><td>대안 사용 가능:</td></tr><tr><td>단일 구멍 펀처</td><td>, Swingline</td><td>74005</td><td></td></tr>, <tr><td>SpeedVac 집중 장치</td>, <td>Martin Christ</td>, <td>RVC 2-25, CDplus</td><td>대안 사용 가능</td></tr><tr><td>: Supelclean ENVI-Carb, SPE 수지</td>, <td>Supelco</td><td>57088</td>, <td>입자 크기: 120-400 mesh. 수지는 카트리지에서 수동으로 추출할 수 있으며 MilliQ 물 주사기에 50%(v/v) 메탄올에 장기간 보관할 수 있습니다</td></tr>. <tr><td>5mL</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z116866</td><td>대안 사용 가능</td></tr><tr><td>온도 제어 인큐베이터</td><td>Thermoline</td><td>E7.30</td><td>대체 사용 가능</td></tr><tr><td>초음파 수조</td><td>Unisonics</td><td>FXP</td><td>대체 사용 가능</td></tr><tr><td>ZIC-HILIC 수지</td><td>Merck</td><td>150455</td><td>입자/기공 크기, 5 &mu; m/200 &Aring;. 레진은 LC 컬럼에서 수동으로 추출할 수 있으며, MilliQ 물</td></tr><tr><td>ZipTip C18 고체상 추출(SPE) 마이크로 컬럼</td>에서 50% (v/v) 메탄올에 장기간 저장할 수 있습니다.<td>Millipore</td><td>ZTC18S096</td><td>대안적으로, 집에서 만든 C18-SPE 마이크로 컬럼이 상업용 제품</td></tr><tr><td>LC-MS/MS Analysis</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1260 Infinity Capillary HPLC 시스템을</td> 대체할 수 있습니다.<td>애질런트</td><td></td><td>대안 사용</td></tr><tr><td>가능 ReproSil-Pur C18 AQ 수지로 사전 포장된 분석 LC 컬럼</td><td>Dr Maisch, Ammerbuch-Entringen, Germany</td><td>r13.aq.s2570</td><td>입자/공극 크기: 3 &mu; m/120 &, 길이/내경: 25cm/75&m. 상업용 C18 나노-LC 컬럼도 사용 가능/&nbsp;</td></tr><tr><td>Dionex UltiMate 3000 RSLCnano LC 시스템&nbsp;</td><td>사용 가능한 열</td><td></td><td>대체품</td></tr>: <tr><td>HyperCarb, KAPPA, PGC, 모세관 LC 컬럼&nbsp;</td><td>Thermo</td><td>단종</td><td>입자/기공 크기, 3 &mu; m/250 &아링;; 열 길이, 30mm; 내경, 0.180mm. 유사한 품질의 데이터를 생성하는 HyperCarb PGC-LC 컬럼의 더 큰 형상이 상업적으로 이용 가능합니다(예: Thermo #35003-031030). 입자/공극 크기를 가진 Merck의 SupelTMCarb LC 컬럼, 2.7 &mu; m/200 및 컬럼 길이와 내경이 다른 제품도 사용할 수 있습니다(예: Merck #59994-U).&nbsp;</td></tr><tr><td>LCMS 등급 아세토니트릴</td><td>LiChrosolv</td><td>100029</td><td>대안 사용 가능</td></tr><tr><td>선형 트랩 사중극자(LTQ) Velos Pro 이온 트랩 질량 분석기(글리코믹스)&nbsp;</td><td>Thermo</td><td></td><td>대체품 사용 가능</td></tr><tr><td>Orbitrap Fusion Lumos Tribrid 질량분석기(당단백질체학)</td><td>Thermo</td><td></td><td>ETD가 있거나 없는 다른 고분해능 MS 시스템(O-당단백질체학에만 필요)도 사용할 수 있습니다(예: Q-Exactive HF-X Hybrid Quadrupole-Orbitrap, Thermo, TIMS-ToF-MS, Bruker 또는 다른 공급업체의 유사한 고성능 질량분석기)</td></tr><tr><td>Total Recovery Clear Glass 스크류 바이알 0.9 mL</td><td>Thermo</td><td>THC11093563</td><td>대안 사용 가능</td></tr><tr><td>총 회수 투명 유리 스크류 바이알과 일치하는 캡</td><td>Thermo</td><td>THC09150869</td><td>대안 사용 가능</td></tr><tr><td>ReproSil-Pur C18 AQ 수지로 자체 포장된 트랩 LC 컬럼&nbsp;</td><td>Dr Maisch, Ammerbuch-Entringen, Germany</td><td>r15.aq.s0202</td><td>입자/기공 크기: 5 &mu; m/120 &, 길이/내경: 2cm/100 >m. 상업용 C18 트랩 LC 컬럼도 사용할 수 있습니다.&nbsp;</td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Byonic</td><td>Protein Metrics Inc</td><td>v2.6.46 이상</td><td>상용 글리코펩타이드 및 PTM 검색 엔진, 대부분의 MS 공급업체로부터 LC-MS/MS 원시 데이터 수용</td></tr><tr><td>Byos</td><td>Protein Metrics Inc</td><td>v3.9-7 이상</td><td>글리코펩타이드 후보의 수동 검사 및 글리칸 MS/MS 스펙트럼 GlycoMod의 자동 주석을 위한 상용 소프트웨어</td></tr><tr><td></td><td>Expasy</td><td></td><td>오픈 액세스 소프트웨어, 글리코믹스 데이터(https://web.expasy.org/glycomod/) 주석 지원</td></tr><tr><td>GlycoWorkBench</td><td>EUROCarbDB</td><td>v2.1</td><td>오픈 액세스 소프트웨어, 글리코믹스 데이터 주석 및 글라이칸 만화 그리기 지원</td></tr><tr><td>RawMeat</td><td>VAST Scientific</td><td>v2.1</td><td>오픈 액세스 소프트웨어, 원시 스펙트럼 데이터에서 글라이칸 전구체 이온의 m/z 추출</td></tr><tr><td>Skyline</td><td>Brendan X. MacLean</td><td>v21.2 이상</td><td>글라이칸의 상대 정량을 위한 오픈 액세스 소프트웨어</td></tr><tr><td>Xcalibur</td><td>Thermo</td><td>v2.2 이상</td><td>원시 LC-MS/MS 데이터 탐색용</td></tr></tbody></table>

glycomics-guided glycoproteomics는 복잡한 종양 미세환경에서 당단백질체의 포괄적인 프로파일링을 용이하게 합니다. 

Glycomics-Guided Glycoproteomics Facilitates Comprehensive Profiling of the Glycoproteome in Complex Tumor Microenvironments

이 섹션에서는 II단계에서 CRC를 앓고 있는 환자의 FFPE 조직 슬라이드에 적용된 글리코믹스 유도 당단백질체학(glycomics-guided glycoproteomics) 방법의 대표적인 결과를 제공합니다.
프로토콜에 대한 충분한 단백질 출발 물질을 달성하기 위해 발표된 프로토콜에 따라 동일한 FFPE 조직 블록에서 두 슬라이드(z 스택)의 단백질 추출물을 결합하고 TMT 라벨링 접근법을 적용하여 당단백질체학 실험의 감도를 높였습니다(아래 옵션 단계 참조)42.
첫째, FFPE CRC 조직의 PGC-LC-MS/MS 기반 N-글리코믹스 데이터를 분석한 결과, 59개의 글라이칸 조성에 걸쳐 총 76개의 N-글라이칸 이성질체가 식별되었습니다(그림 2). CRC 조직43에 대한 이전의 N-글리콤 ...

Glycomics-guided glycoproteomics는 복잡한 종양 미세환경에서 당단백질체의 포괄적인 프로파일링을 용이하게 합니다. 

Glycosylation is a common and structurally diverse protein modification that impacts a wide range of tumorigenic processes. Mass spectrometry-driven ...

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연구

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암 연구

본 연구에서 우리는 특정 단백질의 글리코 실화 프로 파일링에서 사용할 수있는 렉틴 검출 방법과 멀티 플렉스 높은 처리량 항체 microarray를위한 향상된 프로토콜을 설명합니다. 이 프로토콜은 새로운 신뢰할 수있는 시약을 갖추고 있으며 훨씬 이전 절차에 비해 시간, 비용, 연구 장비 요구 사항을 줄여줍니다.

단지 샘플의 특정 단백질 글리코 실화의 다중 높은 처리량 프로파일을위한 화학을 차단 항체 Microarray

Microarrays를 사용하여 식물 세포의 벽 폴리머의 Glycan 프로파일

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암세포 단백질체에 대한 심층 분석은 새로운 약물 표적 및 진단 바이오마커의 식별을 용이하게 합니다. 우리는 액체 및 고체 종양에서 유래한 암세포 하위 집단에서 (인) 단백질체의 정량 분석을 위한 실험적 워크플로우를 설명합니다. 이는 세포 농축 전략과 정량적 Super-SILAC 기반 질량 분석법을 결합하여 달성됩니다.

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이 기사는 GC-MS에 의한 검출을 위해 글리칸을 구성 연결 특이적 단당류로 화학적으로 분해하여 분획되지 않은 생체 유체에서 글리칸의 통합 조성 프로파일을 분석하도록 설계된 새로운 상향식 글리코믹스 기술의 향상된 형태를 제시합니다. 잠재적인 응용 분야에는 암 및 기타 글리칸 정동 장애의 조기 발견이 포함됩니다.

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Sialoglycan Microarray Assay를 사용하여 Human Sera에서 Anti-Neu5Gc IgG 프로파일 링

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