Name: 섬모 형성의 세포 모델에서 음파 고슴도치 신호 전달을 측정하기 위한 정량적 PCR 기반 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-01-31T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 26 s
Description: 배우세요 섬모 세포 모델에서 음파 고슴도치 신호 전달을 정량적 PCR로 측정하는 방법을. RPE-1 세포를 이용하여 유전적 변화와 후성유전적 변화를 평가하고, 1차 섬모 기능을 연구하는 민감하고 재현 가능한 분석 기법을 습득하세요.

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<ol><li>Nigg, E. A., Raff, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Centrioles%2C+centrosomes%2C+and+cilia+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Centrioles, centrosomes, and cilia in health and disease.</a> Cell. 139 (4), 663-678 (2009).</li>
<li>Halder, P., Khatun, S., Majumder, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Freeing+the+brake%3A+Proliferation+needs+primary+cilium+to+disassemble%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biosci%22%5BJournal%5D)">Freeing the brake: Proliferation needs primary cilium to disassemble.</a> J Biosci. 45, 117(2020).</li>
<li>Eguether, T., Cordelieres, F. P., Pazour, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intraflagellar+transport+is+deeply+integrated+in+hedgehog+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Intraflagellar transport is deeply integrated in hedgehog signaling.</a> Mol Biol Cell. 29 (10), 1178-1189 (2018).</li>
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<li>Mukhopadhyay, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ciliary+g-protein-coupled+receptor+gpr161+negatively+regulates+the+sonic+hedgehog+pathway+via+camp+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The ciliary g-protein-coupled receptor gpr161 negatively regulates the sonic hedgehog pathway via camp signaling.</a> Cell. 152 (1-2), 210-223 (2013).</li>
<li>Niewiadomski, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gli+protein+activity+is+controlled+by+multisite+phosphorylation+in+vertebrate+hedgehog+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Gli protein activity is controlled by multisite phosphorylation in vertebrate hedgehog signaling.</a> Cell Rep. 6 (1), 168-181 (2014).</li>
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<li>He, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+kinesin-4+protein+kif7+regulates+mammalian+hedgehog+signalling+by+organizing+the+cilium+tip+compartment%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The kinesin-4 protein kif7 regulates mammalian hedgehog signalling by organizing the cilium tip compartment.</a> Nat Cell Biol. 16 (7), 663-672 (2014).</li>
<li>Wen, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetics+of+hedgehog-dependent+full-length+gli3+accumulation+in+primary+cilia+and+subsequent+degradation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Kinetics of hedgehog-dependent full-length gli3 accumulation in primary cilia and subsequent degradation.</a> Mol Cell Biol. 30 (8), 1910-1922 (2010).</li>
<li>Griffiths, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hedgehog-interacting+protein+is+a+multimodal+antagonist+of+hedgehog+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Hedgehog-interacting protein is a multimodal antagonist of hedgehog signalling.</a> Nat Commun. 12 (1), 7171(2021).</li>
<li>Gomez, A. E., Christman, A. K., Van De Weghe, J. C., Finn, M., Doherty, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+analysis+of+cilia+characteristics+and+hedgehog+signaling+in+five+immortal+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Systematic analysis of cilia characteristics and hedgehog signaling in five immortal cell lines.</a> PLoS One. 17 (12), e0266433(2022).</li>
<li>Schmidt, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+cilia+and+shh+signaling+impairments+in+human+and+mouse+models+of+parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Primary cilia and shh signaling impairments in human and mouse models of parkinson's disease.</a> Nat Commun. 13 (1), 4819(2022).</li>
<li>Dutta, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increase+in+primary+cilia+number+and+length+upon+vdac1+depletion+contributes+to+attenuated+proliferation+of+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Increase in primary cilia number and length upon vdac1 depletion contributes to attenuated proliferation of cancer cells.</a> Exp Cell Res. 429 (2), 113671(2023).</li>
<li>De, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyperphosphorylation+of+cdh1+in+glioblastoma+cancer+stem+cells+attenuates+apc%2Fc%28cdh1%29+activity+and+pharmacologic+inhibition+of+apc%2Fc%28cdh1%2Fcdc20%29+compromises+viability%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Hyperphosphorylation of cdh1 in glioblastoma cancer stem cells attenuates apc/c(cdh1) activity and pharmacologic inhibition of apc/c(cdh1/cdc20) compromises viability.</a> Mol Cancer Res. 17 (7), 1519-1530 (2019).</li>
<li>Yang, S., Zheng, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+immunofluorescence-based+detection+of+hedgehog+pathway+components+in+primary+cilia+of+cultured+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">The immunofluorescence-based detection of hedgehog pathway components in primary cilia of cultured cells.</a> Methods Mol Biol. 2374, 89-94 (2022).</li>
<li>Wang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mir-669a-5p%2Fg3bp%2Fhdac6%2Fakap12+axis+regulates+primary+cilia+length%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Sci+%28Weinh%29%22%5BJournal%5D)">The mir-669a-5p/g3bp/hdac6/akap12 axis regulates primary cilia length.</a> Adv Sci (Weinh). 11 (6), e2305068(2024).</li>
<li>Alanazi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identifying+the+roles+of+mir-17+in+ciliogenesis+and+cell+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Identifying the roles of mir-17 in ciliogenesis and cell cycle.</a> Front Cell Dev Biol. 12, 1397931(2024).</li>
<li>Bustin, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+miqe+guidelines%3A+Minimum+information+for+publication+of+quantitative+real-time+pcr+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Chem%22%5BJournal%5D)">The miqe guidelines: Minimum information for publication of quantitative real-time pcr experiments.</a> Clin Chem. 55 (4), 611-622 (2009).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>DMSO, 멸균 여과</td>된 <td>Sigma</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>Donkey, 마우스 방지 IgG(H+L) Alexa Fluor 488</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A21202</td><td></td></tr><tr><td>당나귀, 토끼 방지 IgG(H+L) Alexa Fluor 568</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A10042</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium(DMEM)</td><td>Gibco, ThermoFisher Scientific</td><td>41965039</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco의 인산염 완충 식염수 (DPBS)</td><td>Gibco, ThermoFisher Scientific</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>Fetal bovine serum (FBS)</td><td>Himedia</td><td>RM1112</td><td></td></tr><tr><td>형광 현미경에 60X 대물렌즈</td><td>Carl Zeiss가</td> 장착되어 있습니다.<td></td><td>Axio observer colibri 5</td></tr><tr><td>hTERT-RPE1 세포</td><td>ATCC</td><td>CRL-4000</td><td></td></tr><tr><td>iScript cDNA 합성 키트</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>1708891</td><td></td></tr><tr><td>Mouse, monoclonal anti-acetylated tubulin 항체</td><td>Milipore Sigma-Aldrich</td><td>T7451</td><td>최종 희석 1:1000</td></tr><tr><td>페니실린-스트렙토마이신, 100X</td><td>Gibco, ThermoFisher Scientific</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>정량 PCR 기계, CFX 96</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td></td><td></td></tr><tr><td>토끼, 다클론 Arl13B 항체</td><td>ProteinTech</td><td>17711-1-AP</td><td>최종 희석 1:250</td></tr><tr><td>토끼, 다클론 Cep135 항체</td><td>ProteinTech</td><td>24428-1-AP</td><td>최종 희석 1:500</td></tr><tr><td>SlowFade gold Antifade moutant</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>S36940</td><td></td></tr><tr><td>Smoothened 아고니스트(SAG)&nbsp;</td><td>Abmole</td><td>M4865</td><td>스톡 솔루션: DMSO, 5 mM</td></tr><tr><td>SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>1725271</td><td></td></tr><tr><td>TRIzol 시약</td><td>Invitrogen</td><td>15596026</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE</td><td>Gibco, ThermoFisher Scientific</td><td>12605028</td><td></td></tr></tbody></table>

섬모 형성의 세포 모델에서 음파 고슴도치 신호 전달을 측정하기 위한 정량적 pcr 기반 분석

Quantitative PCR-based Assay to Measure Sonic Hedgehog Signaling in Cellular Model of Ciliogenesis

PC 매개 SHH 신호 전달 경로의 활성화는 PC7의 적절한 기능을 이해하는 방법입니다. 여기서, SHH 경로 표적 유전자의 상대적 발현은 대부분 섬모화된 RPE1 세포에서 SHH 경로의 SAG 매개 활성화 시 RT-qPCR 분석을 사용하여 측정됩니다. SHH 경로의 직접 전사 출력 GLI1 및 PTCH1은 이 경로11의 활성을 측정하기 위해 자주 사용됩니다. 이 프로토콜에는 SHH 경로에 의해 조절되는 HHIP 전사체도 포함됩니다. SMO는 SHH 경로의 직접적인 표적이 아니기 때문에 SMO의 전사체 수준은 SHH 경로 활성화에 따라 변경되지 않아야 하므로 대조군으로 사용됩니다. β-ACTIN은 혈청이 부족한 RPE1 세포에서 SAG 자극에 따라 수치가 변하지 않기 때문에 정상화에 사용되었습니다(데이터는 표시되지 않음).
이 경우, RPE1 세포를 섬모 형성 유도를 위해 혈청이 부족한 배지에서...

섬모 형성의 세포 모델에서 음파 고슴도치 신호 전달을 측정하기 위한 정량적 PCR 기반 분석

Ciliopathy refers to a collection of multisystemic and polygenic human diseases and disorders that arise due to aberration of structure or function of ...

quantitative-pcr-based-assay-to-measure-sonic-hedgehog-signaling

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

우리는 / β - catenin Wnt와 cardiogenic 유도하는 동안 BMP 신호 활성화를위한 중요한 시간 윈도우를 식별하는 마우스 ES 세포 기반 분석의 사용을 설명합니다. 방법은 안정 cardiogenic 효율성을 단정 표준화된 플랫폼을 제공하고, 다른 세포 lineages의 연구에 적용됩니다.

Cardiogenic 유도 효율을 Quantifying에 대한 수정 마우스 배아의 줄기 세포 기반 어세이

이득 또는 손실 기능을 중재 할 lentivirus를 사용하여 머리 소낭 재생 모델의 조직 별 분석.

헤어 재생시 상피 - 중간 엽 시그널링의 빠른 유전 분석

원고는 여기 Xenopus의에서 찬란 태그 리간드의 분비 및 확산을 분석하는 방법의 간단한 세트를 제공합니다. 이는 리간드 분포를 수정하는 다른 단백질의 능력을 시험하고 morphogen 기울기 조절 메커니즘에 대한 통찰력을 제공 할 수 있도록 실험을위한 컨텍스트를 제공한다.

공 촛점 분석을 사용하여<em&gt; 아프리카 발톱 개구리 laevis의</em&gt;의 Wnt 및 쉬 Morphogen 그라디언트의 변조기를 조사하기 위해

일차 섬모는 다양한 신호 경로에 영향을 미칩니다. 포유류 달팽이관은 평면 세포 극성(PCP) 신호 전달을 검사하는 데 이상적입니다. 섬모 기능 장애는 달팽이관 성장, 세포 패터닝 및 유모 세포 방향, PCP 판독에 영향을 미칩니다. 우리의 목표는 표현형 분석, 면역조직화학 및 주사 전자 현미경을 통해 마우스 달팽이관의 PCP 신호 전달을 분석하는 것입니다.

Ciliopathy 마우스 돌연변이 달팽이관의 평면 셀 극성 표현형의 평가

이 비디오 기사는 체계적이고 효율적으로 많은 무척추 동물 배아에서 복잡한 신호 전달 경로 및 규제 네트워크의 구성 요소를 특성화하는 데 사용할 수있는 생체 방법론에 직접적인을 자세히 설명합니다.

단순함의 힘 : 같은 성게 배아<em&gt; 생체</em&gt; 복잡한 세포 간 신호 전달 네트워크의 상호 작용 유학을위한 발달 모델

우리는 성공적으로 두 기판 전용 γ-secretase 분석 생성 된 있다. 여기에 제시 된 두 세포 기반 분석은 계량 반딧불 luciferase 기자 들의 출력을 통해 γ-secretase 효소 활동 설계 되었습니다.

Γ-Secretase 중재 녹말 체 선구자 단백질 및 세포 기반 Luciferase 기자 시험 플랫폼에 노치 분열의 정량적 측정

미세유동 칩 상에서 마우스 배아 조직의 배양 및 조작을 위한 프로토콜이 제공된다. 경로 조절제의 펄스를 적용함으로써, 이 시스템은 마우스 소미토제네시스의 기능적 조사를 위해 신호전달 진동을 외부적으로 제어하는데 사용될 수 있다.

Somitogenesis를 지배하는 신호 진동의 기능적 조사를위한 미세 유체 학적 접근법

당사는 2D 및 3D 인간 유도 다능성 줄기세포(hIPSC)의 생성 및 특성화에 대한 상세한 프로토콜뿐만 아니라 1차 실슘(PC) 생체 발생 및 기능의 질적 및 정량적 분석을 가능하게 하는 보완적 방법론을 제시합니다.

2D 및 3D 인간 유도 만능 줄기 세포 기반 모델은 신코르티컬 개발 중 1 차용성 개입을 해부합니다.

여기서, 우리는 비용 효율적이고 효율적이며 실행 가능한 1 차성 과립 세포 전구체 (GCP)의 유전 조작을 위한 시험관 내 전기화 프로토콜을 제시합니다. 더욱이, 이 프로토콜은 또한 1 차적인 GCP 세포에 있는 1 차적인 고슴도치 신호 통로의 분자 연구를 위한 간단한 방법을 보여줍니다.

과립 세포 전구체에서 1 차적인 실륨 의존적 신호 경로를 연구하는 효율적이고 비용 효율적인 전기 포기법

코 확장 응답이나 PER는 파리에서뿐만 아니라 꿀벌에서 사용되었습니다 맛을 행동 분석입니다. 코가 매력적인 물질과 접촉하게되면, 비행은 물질을 소비하기 위해 코를 확장합니다. 각종 당분의 솔루션은 비행을 매우 매력적입니다.

Drosophila의 코 확장 응답 (당) 어세이

배우세요 섬모 세포 모델에서 음파 고슴도치 신호 전달을 정량적 PCR로 측정하는 방법을. RPE-1 세포를 이용하여 유전적 변화와 후성유전적 변화를 평가하고, 1차 섬모 기능을 연구하는 민감하고 재현 가능한 분석 기법을 습득하세요.

섬모 형성의 세포 모델에서 음파 고슴도치 신호 전달을 측정하기 위한 정량적 PCR 기반 분석

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