칼슘 이온 채널의 활성화를 연구하기 위한 Single-cell Calcium Imaging

우리는 온도 감각, 노화 감각 및 통증 감각과 관련된 채널을 연구했습니다. 우리는 채널에서의 소분자 활동과 그 메커니즘에 대한 연구를 스크리닝하는 데 관심이 있습니다. 우리는 두 개의 TRPV1 활성화 작용제를 스크리닝하고 그들의 작용 기전에 대한 자세한 연구를 수행했습니다.

이 기술을 사용하면 여러 세포의 칼슘 변화를 실시간, 정량, 동시에 모니터링할 수 있으므로 연구 응용 분야를 위한 간단하고 빠른 접근 방식을 사용할 수 있습니다. 우리는 칼슘 관련 이온 채널의 현대화를 통해 다양한 질병에 대한 전통 한의학 치료 메커니즘을 탐구하는 것을 목표로 합니다. 먼저 직경이 8mm인 멸균 유리 슬라이드를 준비하고 24웰 플레이트에 넣습니다.

각 웰에 500마이크로리터의 Poly-D-lycine 완충액을 추가합니다. 코팅이 가능하도록 섭씨 37도에서 1시간 동안 슬라이드를 배양합니다. 그런 다음 피펫을 사용하여 각 웰에서 코팅 용액을 버리십시오.

Dulbecco의 PBS로 슬라이드를 한 번 세척하고 세척된 슬라이드는 나중에 사용할 수 있도록 따로 보관하십시오. 준비된 24웰 플레이트에 약 1.5 곱하기 10의 밀도로 웰당 5개 세포의 거듭제곱으로 세포를 시딩하고 세포가 부착될 때까지 플레이트를 인큐베이터에 놓습니다. 다음으로, Fura-2/AM 원액과 Pluronic F-127을 1.3밀리몰의 칼슘 이온이 함유된 Hank's buffer와 혼합합니다.

알루미늄 호일을 사용하여 Fura-2/AM 작업 용액을 덮어 빛으로부터 보호합니다. 세포를 전처리하기 위해 세포와 함께 유리 슬라이드를 Hank's buffer가 포함된 새로운 24웰 플레이트로 옮깁니다. 피펫을 사용하여 각 웰에서 버퍼를 버리고 각 웰에 500마이크로리터의 Fura-2/AM 작업 버퍼를 추가합니다.

프로브가 로딩될 수 있도록 실온에서 어두운 곳에서 30분 동안 플레이트를 배양합니다. 그런 다음 각 웰에서 Fura-2/AM 작동 버퍼를 제거하고 Hank's buffer로 셀을 세 번 세척하여 과도한 Fura-2/AM을 제거합니다. 먼저 단일 세포 칼슘 이미징을 위해 전처리된 세포를 얻고 형광 현미경의 모든 구성 요소를 시작합니다.

사용 가능한 옵션에서 형광 이미징 소프트웨어를 엽니다. 필요한 프로토콜을 선택하고 확인을 클릭합니다. 그런 다음 메인 메뉴에서 New Experiment를 선택하여 새로운 실험 설정을 시작합니다.

이제 관류 챔버를 현미경 스테이지에 장착하고 Fura-2/AM 처리된 세포 슬라이드를 Hank의 완충 용액이 들어 있는 챔버에 조심스럽게 놓습니다. 최적의 보기를 위해 백색광 아래에서 초점을 조정합니다. 실험 제어판에서 초점을 선택합니다.

380나노미터와 같이 원하는 초점 파장을 선택하고 Start Focusing(초점 시작)을 클릭하여 초점 조정을 시작합니다. 러프 포커스(Rough Focus)를 사용하여 셀의 초점을 조정하여 목표물을 가까이 가져온 다음 초점 찾기를 사용하여 정확하게 조정합니다. FITC 또는 TRITC의 파장에 의한 표적 단백질의 발현을 관찰합니다.

그런 다음 초점 중지를 클릭하고 초점 패널을 닫습니다. 작업 표시줄에서 Configure Experiment(실험 구성)를 클릭하고 구성 설정에서 이미징을 위해 원하는 층을 선택합니다. 이제 메뉴 표시줄에서 Region(영역) 버튼을 클릭하여 이미징 영역을 정의하고 이미징을 위한 Desired Illumination type(원하는 이미징 유형)을 선택합니다.

Acquire Images를 클릭한 다음 Okay를 눌러 이미지를 캡처합니다. 형광 하에서 표적 단백질을 발현하는 원하는 세포를 식별하고, 380나노미터 미만의 대조군으로 blank 판독값을 고려합니다. 선택한 영역을 실행 취소하려면 원을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 영역 삭제를 선택합니다.

References 메뉴를 열고 Subtract References 상자를 선택한 다음 Okay를 클릭하여 배경 빼기를 적용합니다. 실험 제어판에서 로그 데이터를 클릭하여 실험 데이터를 기록합니다. 제어판의 Time Lapse 섹션에서 Data Acquisition Interval을 1초로 설정합니다.

그런 다음 실험 제어판에서 Zero Clock 및 Acquire를 클릭하여 데이터 수집을 시작합니다. 이제 요구 사항에 따라 세포에 치료를 적용하십시오. 데이터 수집이 완료되면 일시 중지를 클릭하여 프로세스를 중지합니다.

획득한 데이터를 저장하고 분석을 진행합니다. 실험을 종료하려면 파일을 클릭하고 실험 닫기를 선택합니다. 마지막으로 소프트웨어를 닫고 컴퓨터에 저장된 모든 데이터를 전송합니다.

Fura-2 프로브가 장착된 1차 각질세포는 380나노미터 파장에서 가시적인 세포 형태를 보여주었습니다. 각질세포의 열반응은 가열 중 세포 내 칼슘 이온 농도의 증가를 보였으며, 냉각 중에도 유사한 반응이 관찰되었습니다. 열 반응은 각질세포에서 제거되었으며, 열 칼슘 신호전달에서 유전자의 역할을 나타내는 STIM1 유전자가 부족했습니다.

STIM1/Orai1을 과도하게 발현하는 HEK293T 세포는 냉각 시 현저한 열 반응을 보였으며, 이는 녹색 및 적색 형광 마커로 입증된 성공적인 유전자 발현을 확인했습니다. STIM1-Orai1을 과도하게 발현하는 세포의 저장 운영 칼슘 진입 반응은 풍부를 통한 세포외 칼슘 농도 및 Cyclopiazonic Acid edition의 순차적인 변화에 의해 효과적으로 유도되었습니다. TRPV1 작용제인 capsaicine을 직접 피펫팅하여 TRPV1 플라스미드를 발현하는 세포에서 세포 외 칼슘 유입을 유발했습니다.