2025년 4월 25일
이 프로토콜은 간세포 암종(HCC)에서 전신 및 국소 면역 반응을 모두 평가하기 위한 포괄적인 질량 세포 분석(CyTOF(Cytometry by time-of-flight]) 분석 방법을 설명합니다. 이 접근법은 간세포암의 면역 환경에 대한 통찰력을 제공하여 종양 미세환경 및 관련 면역 메커니즘에 대한 더 깊은 이해를 제공하는 것을 목표로 합니다.
질량 세포 분석을 통해 간세포 암종의 체계적 및 국소 면역 반응을 모두 분석할 수 있습니다. 단일 세포 수준에서 면역 세포를 프로파일링함으로써 우리는 종양 진행과 관련된 고유한 하위 집합과 기능 상태를 식별하여 면역 회피 메커니즘과 맞춤형 치료를 위한 잠재적 치료 표적에 대한 통찰력을 제공합니다. 우리의 프로토콜은 질량 세포 분석을 사용하여 단일 세포 수준에서 동시에 14개 이상의 마커를 분석하여 기존 유세포 분석에서 볼 수 있는 스펙트럼 중복을 방지합니다. 여기에는 실제 세포 집단의 정확한 식별이 포함되며 상세한 면역 프로파일링 및 바이오마커 발견을 위한 고차원 데이터를 제공합니다.
[해설자] 시작하려면 냉동 말초 혈액 단핵 세포와 간암 세포 현탁액을 해동합니다. 세포 회수 후 칼슘과 마그네슘이 없는 PBS 1밀리리터에 세포를 재현탁합니다. 시스플라틴을 최종 농도 0.5마이크로몰까지 첨가하고 잘 섞은 후 실온에서 2분 동안 배양합니다. 반응을 멈추려면 튜브를 실온에서 5분 동안 500G에서 원심분리합니다. 상청액을 버린 다음 각 튜브에 1밀리리터의 세포 염색 완충액을 추가합니다. 다시 원심분리한 후 상층액을 조심스럽게 버립니다. FC 수용체 차단을 수행하려면 먼저 각 샘플에 대해 50마이크로리터 블록 믹스를 준비하고 48마이크로리터의 세포 염색 완충액과 2마이크로리터의 FC 차단 용액을 결합합니다. 세포 펠릿을 블록 혼합물에 재현탁하고 배양합니다. 다음으로, 샘플당 각 항체 1.1마이크로리터를 라벨이 부착된 튜브에 첨가하여 막 단백질 항체 혼합물을 준비합니다. 세포 염색 완충액으로 부피를 55마이크로리터로 구성합니다. 준비된 항체 혼합물 50마이크로리터를 각 샘플 튜브로 옮겨 총 부피를 100마이크로리터로 만듭니다. 그런 다음 실온에서 15분 동안 배양하기 전에 샘플을 부드럽게 소용돌이쳐 혼합합니다. 각 샘플 튜브에 1밀리리터의 세포 염색 완충액을 추가합니다. 실온에서 500G에서 5분 동안 원심분리하고 상층액을 버립니다. 최종 세척 후, 세포 펠릿으로 남은 액체를 잠시 소용돌이치게 하여 세포를 완전히 재현탁시킵니다. 핵 단백질 염색을 위해 재현탁된 세포에 500마이크로리터의 혼합 고정 용액을 첨가합니다. 실온에서 30분 동안 배양하기 전에 샘플을 부드럽게 혼합합니다. 배양 후, 실온에서 500G에서 5분 동안 원심분리하고 상청액을 버린다. 다음으로, 1000마이크로리터의 투과화 완충액을 각 튜브에 피펫팅하여 세포를 세척합니다. 그런 다음 튜브를 실온에서 5분 동안 1000G에서 원심분리합니다. 상청액을 버린 후 각 튜브에 50마이크로리터의 항체 혼합물을 첨가합니다. 배양하기 전에 세포를 부드럽게 피펫팅하여 완전히 혼합합니다. 그런 다음 1000마이크로리터의 투과화 완충액을 각 튜브에 피펫팅하고 다시 원심분리한 다음 상층액을 버립니다. 세포를 고정하려면 PBS에서 준비된 1.6% 포름알데히드 1밀리리터를 각 샘플 튜브에 넣고 소용돌이치게 하여 내용물을 완전히 혼합합니다. 실온에서 10분 동안 배양한 후 샘플을 원심분리하고 상청액을 버립니다. 핵 삽입 염색의 경우 먼저 고정 및 투과화 완충액으로 Cell-ID 삽입기 이리듐을 희석합니다. 각 샘플에 삽입 용액 1밀리리터를 피펫팅합니다. 부드럽게 섞고 소용돌이치십시오. 샘플을 섭씨 4도에서 밤새 둔 다음 이전과 같이 원심분리합니다. 배양이 완료되면 1000마이크로리터의 세포 염색 완충액을 튜브에 피펫팅합니다. 튜브를 800G에서 5분 동안 원심분리하고 상층액을 버립니다. 마지막으로, 세포를 450-900마이크로리터의 탈이온수에 재현탁합니다. 추가 분석 전에 세포 계수를 위해 트리판 블루로 세포를 염색합니다. 시작하려면 질량 세포 분석기를 켜고 프로그램을 실행하십시오. CyTOF 시스템에서 샘플을 분석하고 말초 혈액 단핵 세포 및 간암 세포 샘플의 질량 세포 분석 데이터를 수집합니다. 기기에서 데이터 처리 소프트웨어를 실행하고 FCS 파일에서 CD45+ 세포 집단을 전처리합니다. 그런 다음 시스플라틴 배제와 같은 생존율 염색을 사용하여 죽은 세포를 제거합니다. CD45+ 집단을 게이트하여 면역 세포에 초점을 맞추고 추가 분석을 위해 게이트된 집단을 내보냅니다. 5의 보조 인수로 데이터를 변환합니다. 다음으로, 클러스터링 소프트웨어를 실행하고 SPADE 알고리즘을 기반으로 주요 클러스터를 식별하여 유사한 마커 발현 프로필을 가진 세포를 클러스터로 그룹화합니다. 차원 축소 및 별개의 클러스터 식별을 위해 계층적 확률론적 이웃 임베딩(HSNE)을 적용합니다. 그런 다음 소프트웨어에서 CyTOF 키트 패키지를 사용하여 주요 클러스터의 재클러스터링을 수행합니다. PhenoGraph 프로그램을 사용하여 기본 매개변수로 하위 클러스터를 식별합니다. 말초 혈액 단핵 세포 샘플에서 총 14개의 서로 다른 세포 유형이 확인되었습니다. 14가지 세포 유형 각각에 대한 마커 발현 패턴이 히트 맵에 자세히 설명되어 개별 세포 집단에 대한 고유한 발현 프로파일을 보여줍니다. 이러한 세포 유형의 분포는 샘플 D가 더 높은 비율의 CD4 T 세포를 갖고, 샘플 A와 B는 B 세포의 상당한 농축을 나타내며, CD141+는 샘플 C에 주로 존재하는 기존 수지상 세포로 샘플에 걸쳐 다양했습니다. 단핵구, T 세포, 호중구, 자연 살해 세포, B 세포, 형질세포양 수지상 세포, 호산구 및 골수성 수지상 세포. 조직 세포 유형에 대한 마커 발현 프로파일은 각 세포 집단에 대한 고유한 패턴을 나타냅니다. 조직 샘플은 간세포 암종과 공유된 면역학적 특성을 반영하여 모든 환자에서 일관된 비율의 세포 유형을 보여주었습니다.
전체 스크립트를 보고 수천 개의 과학 동영상에 액세스하세요
이 프로토콜은 간세포 암종(HCC)의 전신 및 국소 면역 반응을 평가하기 위한 질량 세포 분석법(CyTOF)을 설명합니다. 단일 세포 수준에서 면역 세포를 프로파일링함으로써, 이 접근법은 종양 진행과 관련된 면역 환경 및 메커니즘에 대한 이해를 발전시킵니다.
Mass cytometry enables high-dimensional, single-cell immune profiling in hepatocellular carcinoma (HCC), addressing the challenge of characterizing complex tumor-immune interactions. This approach enhances predictive confidence in identifying immune cell subsets and functional states relevant to disease progression and therapeutic targeting. Integrating systemic and local immune landscape data supports risk-adjusted portfolio decisions in immuno-oncology R&D.
This mass cytometry workflow bridges early discovery, target validation, and translational research by providing high-resolution immune landscape data in HCC.