2024년 11월 1일
망막 혈관 구조의 주위 세포는 형광 토마토 렉틴의 역궤도 주사 후 혈소판 유래 성장 인자 수용체 β로 면역 형광 염색으로 검사했습니다. 표지된 망막은 조직 제거 방법으로 추가로 처리되었으며 컨포칼 현미경으로 망막 혈관 구조를 둘러싼 주위 세포의 3차원 보기를 시각화하기 위해 전체적으로 장착되었습니다.
본 연구의 범위는 첨단 영상 기술을 이용하여 망막 맥관구조에서 기생충의 형태와 공간적 분포를 연구하는 것이다. 기생충의 형태학적 특성을 입증하기 위한 자세한 관점을 제공하기 위해 본 연구에서는 우리 분야의 연구를 발전시키기 위해 형광제의 안와후주사, 면역형광염색, 조직 투명화 치료를 결합한 새로운 접근법을 설명했습니다.
마우스 망막 조직의 사전 제거 상태와 비교하여 형광 토마토 락틴 및 PDGFR-베타로 표지된 혈관 및 기생충의 배경 신호는 조직 제거 후 현저히 감소하여 공간적 관계를 보다 정확하게 관찰할 수 있습니다.
우리의 결과는 이러한 기술이 전체 망막의 망막 맥관 구조에서 기생충을 입증하는 데 매우 적합하다는 것을 나타냅니다. 이러한 조직학적 기술의 조합은 기생충의 형태학적 특성을 3차원 관점에서 자세히 시각화하는 효과적인 접근 방식입니다.
[강사] 시작하려면 마취된 마우스를 머리가 왼쪽을 향하도록 오른쪽 측면 누운 자세에 놓습니다. 안와 주위 부위를 두 손가락으로 부드럽게 눌러 마우스의 왼쪽 눈을 노출시킵니다. 27게이지 바늘이 장착된 1밀리리터 주사기를 사용하여 안와 정맥동에 약 2-3mm를 부드럽게 찔러 바늘의 경사가 45도 각도로 앞쪽을 향하도록 합니다. 0.1밀리리터의 형광 토마토 락틴을 안와 정맥동에 주입합니다. 안와후 주사 5분 후 마우스를 안락사시키고 수술용 가위를 사용하여 흉강을 엽니다. 좌심실 정점을 통해 좌심실에 24게이지 바늘을 2mm 삽입합니다. 0.9% 생리 식염수 20밀리리터로 분당 3밀리리터의 속도로 관류를 수행한 다음 4% 생리 식염수 20밀리리터를 사용합니다. 0.1몰 인산염 완충액에 0.9% 포름알데히드 0.1밀리리터를 주입합니다. 그런 다음 희생된 쥐를 옆으로 눕히고 가위로 눈을 덮고 있는 피부를 제거합니다. 가위와 겸자로 눈을 적출하십시오. 시신경과 주변 조직을 절단하고 눈을 들어 올립니다. 눈을 12웰 플레이트로 옮겨 0.1몰 인산염 완충액에 4% 포름알데히드에 2시간 동안 고정합니다. 고정 후 눈이 용액 바닥으로 가라앉을 때까지 섭씨 4도의 0.1몰 인산염 완충액에 25% 자당으로 눈을 냉동 보호합니다. 플라스틱 목사 피펫을 사용하여 눈을 0.1몰 인산염 완충액이 들어 있는 페트리 접시로 옮깁니다. 날카로운 가위로 각막의 가장자리를 뚫고 각막과 홍채 주위를 잘라 버립니다. 집게를 사용하여 수정체와 유리체액을 제거합니다. 그런 다음 미세한 집게를 사용하여 컵 모양의 망막을 눈 중앙에서 멀리 당깁니다. 깨끗한 페트리 접시에서 0.1몰 인산염 완충액으로 망막을 헹굽니다. 컵 모양의 마우스 망막을 분리한 후, 섭씨 4도에서 밤새 0.1몰 인산염 완충액에 2% Triton X-100 용액을 넣고 20시간 인큐베이터에서 배양합니다. 다음날 망막을 차단 용액으로 옮기고 섭씨 4도에서 밤새 셰이커에서 72RPM으로 회전합니다. 그런 다음 망막을 희석 완충액에 염소 항-PDGFR 베타의 1차 항체가 들어 있는 미세 원심분리기 튜브에 넣습니다. 섭씨 4도에서 이틀 동안 셰이커의 튜브를 돌립니다. 이틀 후 실온에서 세척 완충액으로 망막을 두 번 세척합니다. 망막을 세척 완충액에 넣고 섭씨 4도에서 밤새 셰이커에 옮깁니다. 다음날, 망막을 당나귀 항염소 488의 2차 항체 밀리리터당 1밀리그램 및 밀리리터 형광 핵염색 DAPI당 0.2나노그램의 용액이 들어 있는 미세 원심분리기 튜브로 옮깁니다. 셰이커의 튜브를 섭씨 4도에서 5시간 동안 72RPM으로 돌립니다. 실온에서 두 번 세척 완충액이 있는 6웰 플레이트에서 망막을 1시간 동안 세척합니다. 섭씨 4도에서 밤새 셰이커의 세척 완충액에서 망막을 배양합니다. 다음날 망막을 조직 투명 시약으로 옮기고 셰이커에서 섭씨 37도에서 1시간 동안 60RPM으로 부드럽게 회전시킵니다. 조직을 제거한 후, 깨끗한 페트리 접시에서 0.1몰 인산염 완충액으로 망막을 헹굽니다. 스프링 가위를 사용하여 망막 반경의 약 2/3에 도달하는 4개의 방사형 절개를 하여 꽃잎 모양을 만듭니다. 망막을 평평하게 펴고 망막 내부가 위를 향하도록 현미경 슬라이드에 장착합니다. 작은 흡수지를 사용하여 과도한 인산염 완충액을 제거합니다. 스페이서로 장착된 망막에 동그라미를 치십시오. 신선한 조직 제거 시약으로 틈을 채우고 그 위에 커버 슬립을 놓습니다. 파노라마 조직 슬라이스 스캐너를 사용하여 라벨링된 망막의 몽타주 보기를 스캔합니다. 개구수가 각각 0.40 및 0.95인 2X 및 10X 렌즈가 장착된 이미징 시스템을 사용하여 더 높은 배율의 이미지를 촬영합니다. 2마이크로미터 프레임으로 라벨링된 망막에서 50Z 스택 이미지를 캡처합니다. 시작 초점면 설정, 끝 초점면 설정, 스텝 크기 설정을 순차적으로 클릭하고 깊이 패턴, 이미지 캡처 및 Z-시리즈를 선택하여 투영 및 지형 모드를 사용하여 모든 이미지를 단일 초점 이미지로 통합합니다. 다음으로, 499 및 519 나노미터의 녹색 형광, 591 및 618 나노미터의 적색 형광, 401 및 421 나노미터의 청색 형광을 사용하여 이미지를 캡처합니다. 새 표면 추가, 볼륨 설정, 소스 채널, 디스플레이 조정, 표면 각도 조정 및 스냅샷을 순차적으로 선택하여 Z-Stack 공초점 이미지를 분석 소프트웨어로 가져오고 이미지를 3차원 패턴으로 재구성합니다. 전체 마운트 망막의 조직 투명도는 조직 투명화가 없는 망막에 비해 조직 투명화 치료 후 증가했습니다. 토마토 렉틴으로 표지된 망막 맥관 구조와 PDGFR-β로 표지된 망막 기생충은 조직 제거 전후에 모두 볼 수 있었지만 조직 제거 후 배경 소음이 감소했습니다. 망막 기생충은 혈관 나무를 따라 관찰되었으며, 망막의 중앙에서 주변 영역으로 그라데이션 분포를 보여주었습니다. 투명한 망막의 3차원 Z-Stack 이미지는 모세혈관에서 더 강한 PDGFR-β 염색으로 다양한 직경의 망막 혈관을 단단히 감싸고 있는 기생충을 보여주었습니다.
이 연구는 고급 이미징 기술을 사용하여 망막 혈관계의 주세포의 형태와 공간 분포를 조사합니다. 형광 염료의 후안와 주사, 면역형광 염색, 및 조직 클리어링 방법을 조합하여 사용하여, 연구는 혈관 주변의 주세포의 시각화를 향상시키는 것을 목표로 합니다.
Three-dimensional visualization of retinal pericytes using immunostaining and tissue clearing enables precise morphological and spatial analysis critical for early-stage vascular target validation. This approach enhances predictive confidence in disease-relevant models by reducing background noise and improving the clarity of pericyte-vasculature interactions. Such high-resolution imaging supports risk-adjusted decisions in ophthalmic and vascular drug discovery portfolios.
This method integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling high-resolution, quantitative imaging of pericytes in whole-mount retina.