Name: 골격근 간질성 세포외 소포체의 효소 분리 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-02-07T12:50:00.000+00:00
Duration: 8 min 50 s
Description: 배우세요 쥐 골격근 간질성 세포외 소포체를 효소 분리 및 차등 초원심분리로 분리하는 방법을. 이 프로토콜은 근육 항상성과 신경근 질환 연구에 활용 가능한 진단 바이오마커 개발에 기여합니다.

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<meta charset="utf8"></head><body>연구 및 치료를 위한 골격근 유래 EV의 최적화된 분리

<ol><li>Yamaguchi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pulsed+ultrasound+promotes+secretion+of+anti-inflammatory+extracellular+vesicles+from+skeletal+myotubes+via+elevation+of+intracellular+calcium+level%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Pulsed ultrasound promotes secretion of anti-inflammatory extracellular vesicles from skeletal myotubes via elevation of intracellular calcium level.</a> Elife. 12, 89512(2023).</li>
<li>Yamaguchi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skeletal+myotube-derived+extracellular+vesicles+enhance+itaconate+production+and+attenuate+inflammatory+responses+of+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Skeletal myotube-derived extracellular vesicles enhance itaconate production and attenuate inflammatory responses of macrophages.</a> Front Immunol. 14, 1099799(2023).</li>
<li>Takada, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+necrosis+factor-%CE%B1+blunts+the+osteogenic+effects+of+muscle+cell-derived+extracellular+vesicles+by+affecting+muscle+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Calcif+Tissue+Int%22%5BJournal%5D)">Tumor necrosis factor-α blunts the osteogenic effects of muscle cell-derived extracellular vesicles by affecting muscle cells.</a> Calcif Tissue Int. 112 (3), 377-388 (2023).</li>
<li>Bourgeois, B. L., Levitt, D. E., Molina, P. E., Simon, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+expression+of+adipocyte+and+myotube+extracellular+vesicle+miRNA+cargo+in+chronic+binge+alcohol-administered+siv-infected+male+macaques%5BTitle%5D)+AND+%22Alcohol%22%5BJournal%5D)">Differential expression of adipocyte and myotube extracellular vesicle miRNA cargo in chronic binge alcohol-administered siv-infected male macaques.</a> Alcohol. 108, 1-9 (2023).</li>
<li>Kargl, C. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angiogenic+potential+of+skeletal+muscle+derived+extracellular+vesicles+differs+between+oxidative+and+glycolytic+muscle+tissue+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Angiogenic potential of skeletal muscle derived extracellular vesicles differs between oxidative and glycolytic muscle tissue in mice.</a> Sci Rep. 13 (1), 18943(2023).</li>
<li>Vann, C. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+microRNA+profiles+of+intramuscular+and+secreted+extracellular+vesicles+in+human+tissue-engineered+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Physiol%22%5BJournal%5D)">Differential microRNA profiles of intramuscular and secreted extracellular vesicles in human tissue-engineered muscle.</a> Front Physiol. 13, 937899(2022).</li>
<li>Anakor, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+neurotoxicity+of+vesicles+secreted+by+als+patient+myotubes+is+specific+to+exosome-like+and+not+larger+subtypes%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">The neurotoxicity of vesicles secreted by als patient myotubes is specific to exosome-like and not larger subtypes.</a> Cells. 11 (5), 845(2022).</li>
<li>Mendhe, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lyophilized+extracellular+vesicles+from+adipose-derived+stem+cells+increase+muscle+reperfusion+but+degrade+muscle+structural+proteins+in+a+mouse+model+of+hindlimb+ischemia-reperfusion+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Lyophilized extracellular vesicles from adipose-derived stem cells increase muscle reperfusion but degrade muscle structural proteins in a mouse model of hindlimb ischemia-reperfusion injury.</a> Cells. 12 (4), 557(2023).</li>
<li>Madison, R. D., Robinson, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscle-derived+extracellular+vesicles+influence+motor+neuron+regeneration+accuracy%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Muscle-derived extracellular vesicles influence motor neuron regeneration accuracy.</a> Neuroscience. 419, 46-59 (2019).</li>
<li>Hanson, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EV-mediated+promotion+of+myogenic+differentiation+is+dependent+on+dose%2C+collection+medium%2C+and+isolation+method%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther+Nucleic+Acids%22%5BJournal%5D)">EV-mediated promotion of myogenic differentiation is dependent on dose, collection medium, and isolation method.</a> Mol Ther Nucleic Acids. 33, 511-528 (2023).</li>
<li>Frimand, Z., Das Barman, S., Kjær, T. R., Porpiglia, E., De Morrée, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+quiescent+stem+cell+populations+from+individual+skeletal+muscles%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation of quiescent stem cell populations from individual skeletal muscles.</a> J Vis Exp. 190, e64557(2022).</li>
<li>Théry, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minimal+information+for+studies+of+extracellular+vesicles+2018+%28misev2018%29%3A+A+position+statement+of+the+international+society+for+extracellular+vesicles+and+update+of+the+misev2014+guidelines%5BTitle%5D)+AND+%22J+Extracell+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (misev2018): A position statement of the international society for extracellular vesicles and update of the misev2014 guidelines.</a> J Extracell Vesicles. 7 (1), 1535750(2018).</li>
<li>Welsh, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minimal+information+for+studies+of+extracellular+vesicles+%28misev2023%29%3A+From+basic+to+advanced+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22J+Extracell+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Minimal information for studies of extracellular vesicles (misev2023): From basic to advanced approaches.</a> J Extracell Vesicles. 13 (2), e12404(2024).</li>
<li>Fan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+proteomics+argues+against+a+general+role+for+CD9%2C+CD81+or+CD63+in+the+sorting+of+proteins+into+extracellular+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22J+Extracell+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Differential proteomics argues against a general role for CD9, CD81 or CD63 in the sorting of proteins into extracellular vesicles.</a> J Extracell Vesicles. 12 (8), e12352(2023).</li>
<li>Baietti, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Syndecan-syntenin-Alix+regulates+the+biogenesis+of+exosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Syndecan-syntenin-Alix regulates the biogenesis of exosomes.</a> Nat Cell Biol. 14 (7), 677-685 (2012).</li>
<li>Shanely, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+skeletal+muscle+biopsy+procedures+using+the+modified+bergstr%C3%B6m+technique%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Human skeletal muscle biopsy procedures using the modified bergström technique.</a> J Vis Exp. (91), e51812(2014).</li>
<li>Mousavi, K., Miranda, W., Parry, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurotrophic+factors+enhance+the+survival+of+muscle+fibers+in+edl%2C+but+not+sol%2C+after+neonatal+nerve+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Neurotrophic factors enhance the survival of muscle fibers in edl, but not sol, after neonatal nerve injury.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 283 (3), C950-C959 (2002).</li>
<li>Liu, L., Cheung, T. H., Charville, G. W., Rando, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+skeletal+muscle+stem+cells+by+fluorescence-activated+cell+sorting%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Isolation of skeletal muscle stem cells by fluorescence-activated cell sorting.</a> Nat Protoc. 10 (10), 1612-1624 (2015).</li>
<li>Ishii, K., Suzuki, N., Mabuchi, Y., Sekiya, I., Akazawa, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Technical+advantage+of+recombinant+collagenase+for+isolation+of+muscle+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Regen+Ther%22%5BJournal%5D)">Technical advantage of recombinant collagenase for isolation of muscle stem cells.</a> Regen Ther. 7, 1-7 (2017).</li>
<li>Motohashi, N., Asakura, Y., Asakura, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation%2C+culture%2C+and+transplantation+of+muscle+satellite+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation, culture, and transplantation of muscle satellite cells.</a> J Vis Exp. (86), e50846(2014).</li>
<li>Mozzetta, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+muscle+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of muscle stem cells.</a> Methods Mol Biol. 1480, 311-322 (2016).</li>
<li>Clemens, Z., Wang, K., Ambrosio, F., Barchowsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arsenic+disrupts+extracellular+vesicle-mediated+signaling+in+regenerating+myofibers%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol+Sci%22%5BJournal%5D)">Arsenic disrupts extracellular vesicle-mediated signaling in regenerating myofibers.</a> Toxicol Sci. 195 (2), 231-245 (2023).</li>
<li>Ma, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skeletal+muscle-derived+extracellular+vesicles+transport+glycolytic+enzymes+to+mediate+muscle-to-bone+crosstalk%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metab%22%5BJournal%5D)">Skeletal muscle-derived extracellular vesicles transport glycolytic enzymes to mediate muscle-to-bone crosstalk.</a> Cell Metab. 35 (11), 2028-2043.e7 (2023).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>0.6 mL 마이크로 원심분리기 튜브</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>05-408-120</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL 마이크로 튜브 (C)&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>5720411009</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL 마이크로 원심분리기 튜브</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>3448</td><td>Clear, graduated, nonsterile</td></tr><tr><td>BD 5 mL 주사기</td><td>Becton Dickinson</td><td>14-827-52&nbsp;</td><td>Luer-Lok 팁</td></tr><tr><td>Cell Counting Slides, Cell Counter용 이중 챔버</td><td>Bio-Rad</td><td>145-0011</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge 5430R</td><td>Eppendorf</td><td>22620667</td><td></td></tr><tr><td>Cleaning solution</td><td>NanoFCM Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Collagenase II</td><td>Worthington Biochemical Corporation</td><td>LS004176</td><td></td></tr><tr><td>DPBS (10x) 액체 (-칼슘,-마그네슘)</td><td>Cytiva</td><td>SH30378.02</td><td>최종 사용 희석액은 1x</td></tr><tr><td>DPBS/Modified (1x)</td><td>Cytiva</td><td>SH30264.02</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)</td><td>Genesee Scientific</td><td>25-500</td><td></td></tr><tr><td>E-POD Pure 물 원격 디스펜서</td><td>Millipore Sigma</td><td>ZRXSP0D01</td><td></td></tr><tr><td>FA-45-30-11 마이크로 원심분리기 로터</td><td>Eppendorf</td><td>05-401-503</td><td></td></tr><tr><td>Fisher Vortex Genie 2</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>12-812</td><td></td></tr><tr><td>Flow NanoAnalyzer</td><td>NanoFCM Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Heratherm OGS60 일반 프로토콜 오븐</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>51028112</td><td>중력 대류, 2.3 cu.ft. 120 V</td></tr><tr><td>MemGlow-488 프로브</td><td>세포골격 Inc.</td><td>MG01-02</td><td></td></tr><tr><td>Millipak Special Millipore</td><td>Millipore Sigma</td><td>TANKMPK02</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Gibco</td><td>15070063</td><td></td></tr><tr><td>Pipet-Lite LTS 피펫 L-1000XLS+</td><td>Rainin</td><td>17014382</td><td></td></tr><tr><td>Pipet-Lite LTS 피펫 L-200XLS+</td><td>Rainin</td><td>17014391</td><td></td></tr><tr><td>Pipet-Lite LTS 피펫 L-20XLS+</td><td>Rainin</td><td>17014392</td><td></td></tr><tr><td>피펫 팁 ER LTS 1000&micro; L F 768G/8</td><td>Rainin</td><td>30808038</td><td></td></tr><tr><td>피펫 팁 ER LTS 20&micro; L F 960G/10</td><td>Rainin</td><td>30807966</td><td></td></tr><tr><td>피펫 팁 ER LTS 200&micro; L F 960G/10</td><td>Rainin</td><td>30807967</td><td></td></tr><tr><td>품질 관리 비드</td><td>NanoFCM Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>S110-AT 고정 각도 로터</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>45539</td><td>1,10,000rpm</td></tr><tr><td>S16 엑소 65-155nm 비드</td><td>NanoFCM Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>가위</td><td>SPI, 미국</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sorvall mX 150+ 마이크로 초원심분리기</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>50135641</td><td></td></tr><tr><td>TC 20 자동 세포 계수기</td><td>Bio-Rad</td><td>1450102</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue Solution</td><td>Corning</td><td>25-900-CI</td><td></td></tr><tr><td>핀셋</td><td>SPI, US</td><td></td><td></td></tr><tr><td>VWR 15mL 원심분리기 튜브</td><td>Avantor</td><td>89039-668</td><td></td></tr><tr><td>Whatman Puradisc 13 필터</td><td>Cytiva</td><td>6782-1304</td><td>0.45 &micro; m 기공 크기</td></tr><tr><td>와일드 타입 C57BL/6J 마우스</td><td>잭슨 연구소</td><td>재고 # 000664</td><td></td></tr></tbody></table>

골격근 간질성 세포외 소포체의 효소 분리

Enzymatic Isolation of Skeletal Muscle Interstitial Extracellular Vesicles

이 프로토콜에 따라 야생형 마우스의 전경골(TA), 장신근(EDL), 가자미암(SOL), 비복근(GAS) 및 대퇴사두근(QUA)을 포함한 다양한 근육 그룹에서 골격근 세포외 소포체(SkM-EV)를 성공적으로 추출했습니다. 이러한 SkM-EV의 후속 특성 분석은 나노 유세포 분석을 통해 수행되었으며, 표 1에 요약된 바와 같이 고유한 특징을 규명했습니다. 놀랍게도, 단 1g의 근육 조직에서 1.18e14 ± 4.86e13 SkM-EVs의 인상적인 수율을 얻었으며, 평균 입자 크기는 73.93nm ± 2.70nm, 중간 입자 크기는 72.55nm ± 2.42nm였습니다. 크기 분포는 13.28nm ± 1.71nm의 차이를 보였으며(그림 5), 이는 EV12,13의 인식된 정의와 정확하게 일치합니다.
<p class="jove_content...

Extracellular vesicles (EVs) are lipid bilayer-enclosed nanoparticles released by cells to transport bioactive cargo, such as proteins, RNAs, and DNAs, ...

enzymatic-isolation-skeletal-muscle-interstitial-extracellular

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

myofibers의 절연과 문화는 황금...

성인 골격근의 개인 Myofibers 및 위성 세포의 분리와 문화

재생 애플리케이션에 이상적이다 인간의 골격 근육 항구 여러 멀티 혈통 전구체 집단 내에서 혈관. 내막 근육 조직에서 혈관 내피 세포, 혈관 주위 세포 매체 및 외막 세포 외막에서이 분리 방법은 혈관의 세 층 구조에서 각각 세 능성 전구 세포 집단의 동시 정제를 허용한다.

인간의 골격 근육에서 혈관 유래 다 능성 전구체의 분리

인간의 근육에서 유래한 주요 부착 세포 유형은 근육 세포와 섬유아세포입니다. 여기에서 세포 집단은 CD56 항원을 기반으로 하는 자기 활성화 세포 분류를 사용하여 농축됩니다. 이후 특정 항체를 사용한 면역 라벨링과 이미지 분석 기법을 사용하여 개별 세포의 세포질 및 핵 특성을 정량화할 수 있습니다.

인간의 골격근에서 기본 근육 조직 세포와 섬유 아 세포의 분리 및 정량 면역 세포 화학 특성

Microvascular 내 피 세포 골격 근육 (MMEC)의 근육 모세 혈관의 안 벽을 형성 하 고 둘 다 조절 근육 조직과 혈액 사이 (면역) 세포의 마이그레이션 및 체액/분자의 교환. 기본 murine MMEC의 격리, 여기에 설명 된 대로 "myovascular 단위"의 종합 체 외 조사 수 있습니다.

기본 Murine 골격 근육 Microvascular 내 피 세포의 고립

여기, 우리는 작은 세포 외 소포 (EVs) 뇌와 종양 견본을 포함 하 여 전체 조직에서 분리 하는 상세한 프로토콜을 제공 합니다. 이 방법은 추가 다운스트림 분석에 대 한 단단한 조직에서 EVs를 추출 하는 재현 기법을 제공 합니다.

전체 조직에서 세포 외 Vesicles의 추출

이 프로토콜은 1) 성체 마우스 비복근에서 일차 섬유아세포를 분리하고 배양하는 방법과 2) 자당 밀도 구배와 웨스턴 블롯 분석을 결합한 차등 초원심분리 방법을 사용하여 엑소좀을 정제하고 특성화하는 방법을 보여줍니다.

골격근 섬유아세포(Skeletal Muscle Fibroblast)에서 엑소좀의 분리 및 특성 분석(Isolation and Characterization of Exosomes from Skeletal Muscle Fibroblasts)

여기에서는 최적화된 차등 초원심분리 방법을 통해 간암 조직에서 유래한 작은 세포외 소포의 농축을 설명합니다.

간암 조직에서 유래한 작은 세포외 소포체의 농축 방법

이 프로토콜은 마우스의 개별 골격근에서 근육 줄기 세포와 섬유 지방 생성 전구체의 분리를 설명합니다. 이 프로토콜에는 단일 근육 해부, 형광 활성화 세포 분류에 의한 줄기 세포 분리, 면역형광 염색에 의한 순도 평가, 5-ethynyl-2'-deoxyuridine 혼입 분석에 의한 S상 진입의 정량적 측정이 포함됩니다.

개별 골격근에서 정지 줄기 세포 집단의 분리

이 프로토콜은 조직 해리, 순차적 여과, 사전 플레이트 및 정의된 배양 조건을 통해 성체 및 신생아 마우스 골격근에서 1차 근모세포를 분리하고 농축하는 표준화된 방법을 제공하여, 위성 세포 유래 근아세포 배양을 하위 실험 응용으로 구축하고 유지할 수 있게 합니다.

시험관 내 근형성 연구를 위한 골격근 위성 세포 분리

이 프로토콜은 산화성 가자형상근에서 온전한 단일 근섬유를 분리하고, 이 섬유에서 유래한 고정제된 근모아 배양을 구축하는 과정을 설명합니다. 최적화된 절차는 마우스당 약 300–500개의 온전한 근섬유를 신뢰성 있게 얻어 하위 분자 및 세포 분석을 가능하게 합니다.

산화성 근섬유 거동 평가를 위한 단일 섬유 분리 분석

이 프로토콜은 효소 소화 및 크기 배제 크로마토그래피를 사용하여 소변 골격근과 골수에서 작은 세포외 소포를 분리하여 구조적으로 복잡하고 저수율 조직에서 소포 농축 분획을 재현 가능하게 회수하여 하위 분자 분석에 활용할 수 있도록 합니다.

크기 배제 크로마토그래피를 이용한 쥐 골격근 및 골수에서 작은 세포외 소포 분리

배우세요 쥐 골격근 간질성 세포외 소포체를 효소 분리 및 차등 초원심분리로 분리하는 방법을. 이 프로토콜은 근육 항상성과 신경근 질환 연구에 활용 가능한 진단 바이오마커 개발에 기여합니다.

골격근 간질성 세포외 소포체의 효소 분리

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