Name: 배추속의 저산소증 내성을 연구하기 위한 양배추 Protoplast System 개발 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-09-20T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 9 s
Description: 배우세요 양배추 프로토플라스트 시스템을 이용한 저산소증 내성 분석 방법을. 효율적인 전염과 리포터 분석을 통해 배추속 식물의 홍수 스트레스 유전 메커니즘을 규명하고 개량 품종 개발에 기여합니다.

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<meta charset="utf8"></head><body>홍수 내성 메커니즘을 연구하기 위한 효율적인 양배추 Protoplast 시스템

<ol><li>Tanoue, M., Hirabayashi, Y., Ikeuchi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global-scale+river+flood+in+the+last+50+years%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Global-scale river flood in the last 50 years.</a> Sci Rep. 6 (1), 36021(2016).</li>
<li>Voesenek, L. aC. J., Bailey-Serres, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flood+adaptive+traits+and+processes%3A+An+overview%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytol%22%5BJournal%5D)">Flood adaptive traits and processes: An overview.</a> New Phytol. 206 (1), 57-73 (2015).</li>
<li>Sheen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signal+transduction+in+maize+and+Arabidopsis+mesophyll+protoplasts%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Signal transduction in maize and Arabidopsis mesophyll protoplasts.</a> Plant Physiol. 127 (4), 1466-1475 (2001).</li>
<li>Chen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+highly+efficient+transient+protoplast+system+for+analyzing+defense+gene+expression+and+protein-protein+interactions+in+rice%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Plant+Pathol%22%5BJournal%5D)">A highly efficient transient protoplast system for analyzing defense gene expression and protein-protein interactions in rice.</a> Mol Plant Pathol. 7 (5), 417-427 (2006).</li>
<li>Yoo, S. -D., Cho, Y. -H., Sheen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arabidopsis+mesophyll+protoplasts%3A+A+versatile+cell+system+for+transient+gene+expression+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Arabidopsis mesophyll protoplasts: A versatile cell system for transient gene expression analysis.</a> Nat Protoc. 2 (7), 1565-1572 (2007).</li>
<li>Wang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+protoplast+isolation%2C+transformation%2C+and+its+application+in+sugarcane+%28Saccharum+spontaneum+L%29%5BTitle%5D)+AND+%22Crop+J%22%5BJournal%5D)">Optimization of protoplast isolation, transformation, and its application in sugarcane (Saccharum spontaneum L).</a> Crop J. 9 (1), 133-142 (2021).</li>
<li>Adedeji, O. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+protocol+for+efficient+protoplast+isolation+and+transient+gene+expression+in+carnation%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Hortic%22%5BJournal%5D)">Optimization of protocol for efficient protoplast isolation and transient gene expression in carnation.</a> Sci Hortic. 299, 111057(2022).</li>
<li>Lin, H. -Y., Chen, J. -C., Fang, S. -C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+protoplast+transient+expression+system+to+enable+molecular%2C+cellular%2C+and+functional+studies+in+Phalaenopsis+orchids%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Plant+Sci%22%5BJournal%5D)">A protoplast transient expression system to enable molecular, cellular, and functional studies in Phalaenopsis orchids.</a> Front Plant Sci. 9, (2018).</li>
<li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+highly+efficient+mesophyll+protoplast+isolation+and+PEG-mediated+transient+expression+system+in+eggplant%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Hortic%22%5BJournal%5D)">A highly efficient mesophyll protoplast isolation and PEG-mediated transient expression system in eggplant.</a> Sci Hortic. 304, 111303(2022).</li>
<li>Lin, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+protoplast+isolation+system+for+functional+gene+expression+and+characterization+using+petals+of+Camellia+oleifera%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol+Biochem%22%5BJournal%5D)">Development of a protoplast isolation system for functional gene expression and characterization using petals of Camellia oleifera.</a> Plant Physiol Biochem. 201, 107885(2023).</li>
<li>Guo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+isolation+of+Populus+mesophyll+protoplasts+and+its+application+in+transient+expression+assays%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+One%22%5BJournal%5D)">Highly efficient isolation of Populus mesophyll protoplasts and its application in transient expression assays.</a> PLOS One. 7 (9), e44908(2012).</li>
<li>Gottschald, O. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TIAR+and+TIA-1+mRNA-binding+proteins+co-aggregate+under+conditions+of+rapid+oxygen+decline+and+extreme+hypoxia+and+suppress+the+HIF-1%CE%B1+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">TIAR and TIA-1 mRNA-binding proteins co-aggregate under conditions of rapid oxygen decline and extreme hypoxia and suppress the HIF-1α pathway.</a> J Mol Cell Biol. 2 (6), 345-356 (2010).</li>
<li>Cho, H. -Y., Chou, M. -Y., Ho, H. -Y., Chen, W. -C., Shih, M. -C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ethylene+modulates+translation+dynamics+in+Arabidopsis+under+submergence+via+GCN2+and+EIN2%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Adv%22%5BJournal%5D)">Ethylene modulates translation dynamics in Arabidopsis under submergence via GCN2 and EIN2.</a> Sci Adv. 8 (22), eadm7863(2022).</li>
<li>Boudreau, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Excitation+light+dose+engineering+to+reduce+photo-bleaching+and+photo-toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Excitation light dose engineering to reduce photo-bleaching and photo-toxicity.</a> Sci Rep. 6 (1), 30892(2016).</li>
<li>Shcherbakova, D. M., Cox Cammer, N., Huisman, T. M., Verkhusha, V. V., Hodgson, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+multiplex+imaging+and+optogenetics+of+Rho+GTPases+enabled+by+near-infrared+FRET%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Direct multiplex imaging and optogenetics of Rho GTPases enabled by near-infrared FRET.</a> Nat Chem Biol. 14 (6), 591-600 (2018).</li>
<li>Jiang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sodium+sulfite+is+a+potential+hypoxia+inducer+that+mimics+hypoxic+stress+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Inorg+Chem%22%5BJournal%5D)">Sodium sulfite is a potential hypoxia inducer that mimics hypoxic stress in Caenorhabditis elegans.</a> J Biol Inorg Chem. 16 (2), 267-274 (2011).</li>
<li>Lin, C. -C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SUB1A-1+anchors+a+regulatory+cascade+for+epigenetic+and+transcriptional+controls+of+submergence+tolerance+in+rice%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS+Nexus%22%5BJournal%5D)">SUB1A-1 anchors a regulatory cascade for epigenetic and transcriptional controls of submergence tolerance in rice.</a> PNAS Nexus. 2 (7), pgad229(2023).</li>
<li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bis-molybdopterin+guanine+dinucleotide+modulates+hemolysin+expression+under+anaerobiosis+and+contributes+to+fitness+in+vivo+in+uropathogenic+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Bis-molybdopterin guanine dinucleotide modulates hemolysin expression under anaerobiosis and contributes to fitness in vivo in uropathogenic Escherichia coli.</a> Mol Microbiol. 116 (4), 1216-1231 (2021).</li>
<li>Liu, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+light+and+hypoxia-induced+gene+zmPORB1+determines+tocopherol+content+in+the+maize+kernel%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+China+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">The light and hypoxia-induced gene zmPORB1 determines tocopherol content in the maize kernel.</a> Sci China Life Sci. 67 (3), 435-448 (2024).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>2-(N-morpholino) ethanesulfonic Acid (MES)</td><td>PhytoTech Labs</td><td>M825</td><td>효소 용액 준비용</td></tr><tr><td>228 양배추 씨앗</td><td>Takii & Co., Ltd. (Kyoto, Japan)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 mL Conical Tube</td><td>SPL Life Sciences</td><td>50050</td><td>효소 용액 준비용</td></tr><tr><td>6-well tissue culture plate</td><td>Alpha Plus</td><td>16106</td><td>원형질체 배양용</td></tr><tr><td>70 &뮤; m 세포 여과기</td><td>Sorfa&nbsp;</td><td>SCS701</td><td>프로토플라스트 여과용</td></tr><tr><td>9-cm 페트리 접시</td><td>알파 플러스</td><td>16001</td><td>효소 소화용</td></tr><tr><td>혐기성 항아리</td><td>HIMEDIA</td><td>혐기성 항아리 3.5 L</td><td>저산소증 치료용&nbsp;</td></tr><tr><td>소 혈청 알부민</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906</td><td>W5 용액 준비 및 배양 플레이트 코팅</td></tr><tr><td>염화칼슘</td><td>J.T.Baker</td><td>131301</td><td>W5 용액 및 PEG 용액 준비</td></tr><tr><td>셀룰라제 R10</td><td>야쿠르트</td><td></td><td>효소 용액 준비</td></tr><tr><td>Desiccator</td><td>Tarsons&nbsp;</td><td>402030</td><td>진공 침투용</td></tr><tr><td>D-Glucose</td><td>Bioshop</td><td>GLU501</td><td>W5 용액 준비용</td></tr><tr><td>용존 산소 측정기</td><td>Thermo Scientific</td><td>Orion Star A223</td><td>산소 측정용</td></tr><tr><td>D-Mannitol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1902</td><td>효소 용액, PEG 용액 및 MMG 용액 준비용</td></tr><tr><td>Dual-Luciferase Reporter Assay System</td><td>Promega</td><td>E1960</td><td>이중 루시페라제 리포터 분석용</td></tr><tr><td>EC-Oxyrase</td><td>Oxyrase Inc.</td><td>EC-0005</td><td>저산소증 치료용</td></tr><tr><td>Fuyudori 양배추 씨앗</td><td>Kobayashi Seed Co., Ltd. (Kakogawashi, Japan)</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>고속 냉장 원심분리기</td><td>Hitachi</td><td>CR21GIII</td><td>원형질 수확용</td></tr><tr><td>Macerozyme R10&nbsp;</td><td>야쿠르트</td><td></td><td>효소 용액 준비용</td></tr><tr><td>염화마그네슘</td><td>Alfa Aesar</td><td>12315</td><td>MMG 용액 준비용</td></tr><tr><td>마이크로 원심분리기</td><td>Hitachi</td><td>CT15RE</td><td>프로토플라스트 수확용</td></tr><tr><td>마이크로플레이트</td><td>Greiner</td><td>655075</td><td>Dual-luciferase 리포터 분석용</td></tr><tr><td>마이크로플레이트 리더</td><td>분자 장치</td><td>SpectraMax Mini</td><td>용 이중 루시퍼라제 리포터 분석</td></tr><tr><td>Millex 0.22 &mu; m 주사기 필터</td><td>Merck</td><td>SLGP033RS</td><td>효소 용액 준비용</td></tr><tr><td>오일 프리 진공 펌프</td><td>로커&nbsp;</td><td>진공 침투용</td> <td>로커 300</td></tr><tr><td>OxyFluor</td><td>Oxyrase Inc.</td><td>OF-0005</td><td>저산소증 치료용</td></tr><tr><td>산소흡수제 팩</td><td>Mitsubishi Gas Chemical Company</td><td>AnaeroPack, MGCC1</td><td>저산소증 치료용</td></tr><tr><td>산소 발생기</td><td>UTMOST PERFECT</td><td>AII-X</td><td>W5 용액에서 산소 버블링용</td></tr><tr><td>플랜트 기판</td><td>Klasmann-Deilmann</td><td>Potgrond H 기판</td><td>양배추 묘목용 준비</td></tr><tr><td>플라스미드 미디 키트</td><td>QIAGEN</td><td>12145</td><td>transfection-grade plasmid DNA의 정제를 위해&nbsp;</td></tr><tr><td>폴리에틸렌 글리콜 4000</td><td>플루카</td><td>81240</td><td>원형질 트랜스펙션</td></tr><tr><td>염화칼</td>륨 <td>J.T.Baker</td><td>304001</td><td>W5 용액 준비</td></tr><tr><td>면도날</td><td>질레트</td><td></td><td>양배추 잎 스트립 준비</td></tr><tr><td>염화나트륨</td><td>Bioshop</td><td>SOD002</td><td>W5 솔루션 준비</td></tr> 아<tr><td>황산나트륨</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0505</td><td>저산소증 처리를 위해</td></tr><tr>효소 <td>해결책 준비를 위해</td> <td>물 목욕</td><td>Yihder</td><td>BU-240D</td></tr></tbody></table>

배추속의 저산소증 내성을 연구하기 위한 양배추 protoplast system 개발

Development of a Cabbage Protoplast System for Studying Hypoxia Tolerance in Brassica

이 연구는 양배추 원형질체를 활용하는 일시적 발현 시스템을 성공적으로 개발했습니다(워크플로우는 그림 1 참조). 프로토플라스트는 셀룰라아제/마케로자임 소화 및 암진공 침투를 사용하여 상업용 양배추 품종 'Fuyudori' 및 '228'의 적절한 크기(그림 2A)인 2주에서 3주 된 양배추 잎에서 분리했습니다(그림 2B, C). 배양 중 물에 잠긴 원형질체가 경험하는 저산소 상태를 완화하기 위해 W5 용액은 산소 기계에 연결된 에어 스톤 버블러를 사용하여 산소화되었습니다(그림 2D). 이 과정은 W5 용액의 용존 산소 농도를 7.84 mg· L-1 ± 0.05 mg· L-1 내지 29.18 mg· L-1 ± 0.43 mg· 산소 거품이 일고 5분 후 L-1. 분리 과정에 따라 원형질체의 수율은 하룻밤 소화 기간 후 'Fuyudori'의 경우 1.04 x 107, '228'의 경우 4.00 x 106 protoplasts·g-1 fresh weight였습니다(그림 2E). 그 후, GFP를 PEG 매개 형질주입 방법의 형질전환 효율을 평가하기 위한 리포터 유전자로 사용되었으며, 양배추의 프로토플라스트 형질주입 효율이 두 품종 모두에서 40% 이상임을 입증하여(그림 2F) 이 시스템의 생존 가능성을 확인했습니다.
또한, 양배추 혐기성 호흡 반응 유전자의 프로모터 구성물인 BoADH1p::Luc 및 BoSUS1Lp::Luc 벡터(그림 3A)를 여러 처리의 저산소 유도 효과를 평가하기 위해 양배추 원형질체에 리포터로 도입했습니다. 이 과도 발현 모델 시스템에는 다양한 산소 조절 처리도 적용되었습니다. 그 결과, 아황산나트륨을 제외한 모든 산소 제거 처리는 양배추 원형질체에서 저산소증 반응을 성공적으로 유도하는 것으로 나타났습니다(그림 3B). 구체적으로, BoADH1 의 프로모터 활성은 EC-Oxyrase 및 OxyFluor 처리 후 대조군에 비해 각각 약 2.6배 및 3.2배 증가했으며, 특히 산소흡수제 팩 처리군에서는 7.0배 이상 증가했습니다(그림 3B). 마찬가지로, BoSUS1L 프로모터 활성은 EC-Oxyrase 및 OxyFluor 처리에서 각각 약 1.7배 및 1.8배 증가한 반면, 산소흡수제 팩 처리는 5.6배 이상의 상당한 증가를 유도했습니다(그림 3B). 이러한 결과는 산소흡수팩이 이 양배추 원형질체 실험 시스템에서 저산소 환경을 조성하는 데 탁월한 효능을 입증했음을 시사합니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67444/67444fig01.jpg"> 
그림 1: protoplast 분리 워크플로우의 그래픽 표현. 이 그림은 양배추 잎 조직에서 원형질체를 분리하는 것과 관련된 단계별 과정을 보여줍니다. 절차를 명확하게 이해할 수 있도록 워크플로가 시각적으로 표시됩니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67444/67444fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67444/67444fig02v2.jpg"> 
그림 2: 양배추의 잎 조직에서 원형질체를 분리. (A) 권장 성장 단계에서 상업용 양배추 품종 'Fuyudori' 및 '228'의 출현을 보여줍니다. 2-잎 단계에서 양배추의 두 번째로 새로 완전히 확장된 진잎(화살촉으로 표시)은 원형질체 분리를 위해 선택됩니다. 눈금 막대 : 2cm. (B) 양배추 잎 스트립의 진공 침투 공정에는 진공 펌프와 건조기가 사용되며, 효소 분해 전에 30 분 동안 침투가 수행됩니다. (C) 효소 소화 중 양배추 잎 스트립의 상태가 묘사되어 있습니다. 잎 조직을 완전히 소화하려면 총 4-16시간이 필요합니다. 눈금 막대 : 3cm. (D) 사진은 W5 용액의 용존 산소 농도를 증가시키기 위해 에어 스톤에 연결된 산소 발생기를 사용하는 것을 보여줍니다. 눈금 막대 : 5cm. (E) 4.00 x 10 이상의 신선한 무게 (FW) 그램 당6 개의 중엽 원형질체를 'Fuyudori'및 '228'양배추 품종에서 얻어 현미경으로 관찰했습니다. 눈금 막대 : 200 μm. (F) 구성적으로 발현된 GFP 리포터를 사용하여 두 양배추 유전자형의 프로토플라스트의 형질주입 효율은 40% 이상인 것으로 나타났습니다. 눈금 막대 : 200 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67444/67444fig02largev2.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67444/67444fig03.jpg"> 
그림 3: 산소 결핍 조건에서 양배추 원형의 저산소증 반응. (A) 저산소증 반응 유전자 구성물인 BoADH1 및 BoSUS1L 프로모터는 '후유도리' 양배추 원형질체의 저산소증 반응을 평가하기 위한 리포터로 활용됩니다. (B) 총 5μg의 리포터 플라스미드를 'Fuyudori' 양배추 원형질체로 형질주입하고, 이 양배추는 4시간 동안 저산소증 치료에 노출되기 전에 산소 기포 W5 용액에서 배양됩니다. W5 용액에 EC-oxyrase(0.6 unit·mL-1), OxyFluor(0.6 units·mL-1) 및 아황산나트륨(1 g·mL-1)을 첨가하여 배양 중 산소 농도를 줄입니다. 산소 흡수 팩 치료는 3.5L 혐기성 항아리에 두 개의 산소 흡수 백을 넣어 수행됩니다. "CK" 그룹은 저산소증 치료가 없는 대조군을 나타냅니다. 처리 후, 이중 루시페라아제 분석을 위해 프로토플라스트를 수확합니다. 각 값은 평균 ± SD를 나타내며 n = 4입니다. 다른 문자는 LSD 사후 테스트를 사용한 일원 분산 분석을 기반으로 유의한 차이(P &lt; 0.05)를 나타냅니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67444/67444fig03large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
표 1: 효소 용액, W5 용액 및 MMG 용액의 제조. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67444/Table%201.xlsx" target="_blank">이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 파일 1: 프로토플라스트 트랜스펙션을 위한 플라스미드 세부 정보. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67444/Plasmids.zip" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>

배추속의 저산소증 내성을 연구하기 위한 양배추 Protoplast System 개발

As climate change brings more heavy rainfall, cabbage, a key Brassicaceae vegetable, faces significant yield losses due to flooding-induced hypoxia ...

development-cabbage-protoplast-system-for-studying-hypoxia-tolerance

Research

연구

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Biology

생물학

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14 일 된 모종의 조직에서 Protoplasts의 분리 Arabidopsis thaliana</em

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의 장기, 고해상도 공 촛점 시간 경과 영상<em&gt; Arabidopsis 떡잎</em발아시&gt; 표피

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전략은 트로픽 응답에 Callose 매개 Plasmodesmal 게이팅의 역할을 확인하려면

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감자의 단일 및 결합 스트레스에 대한 형태학적 및 생리학적 반응을 결정하기 위한 고처리량 이미지 기반 표현형 분석

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