Name: Generating Spheroids from Various Chondrocytes using Low-Adhesive Conditions under Gravity and Homemade Mini-Bioreactors (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-01-31T13:20:00.000+00:00
Duration: 9 min 3 s
Description: 학습하세요 iPSC에서 연골세포 스페로이드를 생성하는 방법을 저부착 조건과 미니 바이오리액터를 활용하여. 이 기술은 만성 관절 질환의 연골 재생 치료에 활용됩니다.

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이 연구는 LOPUKHIN FRCC PCM(2019년 4월 9일 프로토콜 번호 2019/02)의 윤리 위원회에서 검토 및 승인되었습니다. 모든 기증자 샘플은 헬싱키 선언의 원칙에 따라 획득되었습니다. 모든 참가자 및/또는 법적 보호자로부터 사전 동의를 받았습니다.
참고: 프로토콜 전반에 걸쳐 멸균 기술을 유지합니다. 모든 배양 배지와 용액을 세포 또는 스페로이드에 적용하기 전에 37°C로 가열합니다. 37°C의 CO2 인큐베이터에서 80% 습도에서 5% CO2 로 세포를 배양합니다. 프로토콜 체계는 그림 1에 나와 있습니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67481/67481fig1.jpg"> 
그림 1: iPSC 라인 IPSRG4S에서 연골구를 생성하기 위한 프로토콜. (A) 초기에 iPSC는 80% 포화도에 도달할 때까지 만능 줄기 세포 배지에서 배양됩니다. (B) 연골세포 계통으로의 분화를 유도하기 위해 iPSC를 배지 A에서 2일 동안 배양합니다. 그 후 배지를 Chir 99021 및 Rho kinase 억제제가 결핍된 제형으로 대체하고, 세포를 2일마다 배지 변화로 추가로 6일 동안 배양합니다. (C) 그런 다음 세포를 배지 B로 옮겨 다음 10일 동안 연골 형성을 촉진합니다. (D) 충분한 세포 수가 달성되면 공정은 스페로이드 생산 단계로 진행됩니다. (E) 세포는 중력 하에서 접착력이 낮은 조건에서 스페로이드로 응집됩니다. (F) 생성된 스페로이드는 배지 B를 갖는 미니 생물반응기에서 배양됩니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67481/67481fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
1. 페트리 접시를 미니 생물 반응기로 변환
참고 : 이전 기사의 세부 정보5.
<ol>
	<li>멸균 오토클레이브 가위를 사용하여 원심분리기 튜브를 7-8mm 높이의 고리로 자릅니다(오토클레이브 설정: 15psi에서 121°C(250°F), 30분 및 20분 동안 오토클레이브 후 건조).</li>
	<li>접착력이 낮거나 처리되지 않았거나 미생물 학적 페트리 접시를 작은 조각으로 부수십시오. 약 1g의 플라스틱 입자를 클로로포름 10mL에 하룻밤 동안 녹여 액체 플라스틱 용액을 만듭니다. 흄 후드에서 이 절차를 수행하십시오.</li>
	<li>액체 플라스틱이 피펫팅에 충분히 점성이 있는지 확인합니다. 액적이 표면에 퍼지지 않고 구형을 유지하는지 확인하십시오. 용액이 너무 묽으면 일반적으로 1-3g이 필요한 플라스틱 입자를 더 추가하십시오. 너무 두꺼우면 일반적으로 최대 5mL가 필요한 클로로포름을 추가로 첨가하십시오.</li>
	<li>아래에 설명된 두 가지 효과적인 방법 중 하나를 사용하여 멸균, 초저접착 60mm 페트리 접시 중앙에 플라스틱 손잡이를 형성합니다.<ol>
		<li>옵션 1 : 오토 클레이브 플라스틱 링을 페트리 접시 중앙에 놓고 링 내부에 액체 플라스틱을 바르십시오. 한 방울에는 약 100-200μL의 액체 플라스틱 방울이 필요합니다.</li>
		<li>옵션 2: 플라스틱 링을 사용하지 않고 동일한 수의 액체 플라스틱 방울을 페트리 접시 중앙에 직접 바릅니다.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>층류 후드에서 뚜껑을 덮지 않은 상태로 접시를 2-3시간 동안 건조시킵니다. 건조 후 접시를 20-30분 동안 자외선에 노출시킵니다.</li>
</ol>
2. 젤라틴을 사용한 문화 접시 처리
<ol>
	<li>분말 젤라틴을 95°C의 증류수에 녹여 0.1% 젤라틴 용액을 준비합니다. 용액을 0.45μm 및 0.25μm 멤브레인 필터에 순차적으로 통과시킨 다음 여과액을 4°C에서 보관합니다.</li>
	<li>연골세포 재파종 직전에 3mL의 젤라틴 용액을 25cm2 플라스크에 도포합니다(T25 플라스크당 최대 15g의 연골 조직 권장). 실온(RT)에서 30분 동안 배양하고 젤라틴을 제거하고 PBS로 두 번 헹구고 세포 파종을 진행합니다.</li>
</ol>
3. 연골 세포의 분리 및 재배
참고: 연골세포는 무릎 전치환술을 받는 환자의 체중을 지탱하지 않는 연골 부위에서 분리됩니다. 멸균 상태에서 모든 검체를 채취하고 200U/mL 페니실린/스트렙토마이신 용액이 들어 있는 DMEM으로 채워진 멸균 튜브에 보관합니다. 연골 조직은 2-8 °C의 냉장고에 보관하십시오.
<ol>
	<li>연골 채취 후 2일 이내에 효소 치료를 시작하십시오. 60mm 페트리 접시를 사용하여 행크스 용액으로 연골 조각을 씻은 다음 오토클레이브 가위를 사용하여 연골을 직경 약 1-2mm의 조각으로 자릅니다.</li>
	<li>연골 조각을 15mL 튜브로 옮기고 DMEM의 0.01% 콜라겐분해효소 II형 용액(연골 1g당 약 1mL)으로 150-200rpm의 오비탈 쉐이커에서 연속 교반하면서 37°C, 5% CO2, 100% 습도로 설정된 CO2 인큐베이터에서 8-12시간 이내에 분해합니다.</li>
	<li>분해 후 15mL 튜브에 DMEM을 첨가하여 연골 조각을 세척한 다음 300×g에서 10 분 동안 원 심분리합니다. 연골세포 배양 배지(보충 표 1)에 단편을 재현탁하고 0.1% 젤라틴 용액으로 사전 코팅된 접착 T25 플라스크에 파종합니다.</li>
	<li>계대 연골 세포는 80%의 합류 밀도가 달성될 때 발생합니다.<ol>
		<li>계대 형성을 위해 Hanks' solution으로 연골 세포를 세척한 다음 37°C에서 5분 동안 0.25% 트립신 용액으로 세포를 배양합니다.</li>
		<li>트립신을 비활성화하려면 동일한 부피의 DMEM + 10% FBS를 추가합니다. 신선한 배양 배지에 연골 세포를 재현 탁 한 다음 1 : 3 비율로 배포하여 1cm 당 20,000-30,000 개의 세포를 파종합니다2.</li>
		<li>배양 플라스크를 37°C, 5% CO2 및 100% 습도의 인큐베이터에 넣습니다.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 만능줄기세포의 배양
참고:이전 연구에서 iPSC 계열 IPSRG4S 인공 지능 Virtanen 연구소, A.I. Virtanen Institute, 신경생물학과 분자 뇌 연구 그룹의 줄기 세포 실험실과 협력하여 iPSC 라인 이 성공적으로 생성되었습니다.
<ol>
	<li>세포외 단백질을 포함하는 매트릭스로 사전 코팅된 6웰 플레이트에서 iPSC를 배양합니다( 그림 1A). 만능 줄기세포에 배지를 사용한다(보충 표 1).</li>
	<li>80% 밀도에서 계대 세포, 1:4 비율(1cm당 50,000-75,000개 세포2)을 유지합니다. 박리 약 2-3시간 전에 1일 동안 최종 농도 1μM에서 Rho kinase inhibitor Y27632를 함유한 만능 줄기세포용 배지로 iPSC를 전달합니다.</li>
	<li>Hanks의 용액으로 iPSC를 세척하고 0.05% 트립신 용액으로 37°C에서 배양합니다. 트립신을 비활성화하려면 동일한 부피의 DMEM + 10% FBS를 추가합니다. 15mL 튜브에서 200 x g 의 세포 현탁액을 5분 동안 원심분리합니다.</li>
	<li>상등액을 버리고 만능 줄기세포를 위한 새로운 배지에 세포를 재현탁합니다. 세포 생존율을 높이기 위해 Rho kinase inhibitor Y27632를 1일 동안 최종 농도 1μM로 배지에 첨가합니다. 배양 플레이트를 37°C, 5% CO2 및 100% 습도로 설정된 CO2 인큐베이터에 놓습니다.</li>
</ol>
5. iPSC의 연골형성 분화
<ol>
	<li>처음 2일 동안 Medium A(보충 표 1)에서 세포를 배양하여 연골세포 계통으로 분화를 시작합니다. 3일차에 Medium A를 Chir 99021 및 Rho kinase 억제제를 제외한 용액으로 교체하고 다른 모든 성분은 변경하지 않습니다. 3일차부터 9일차까지 2일마다 매체를 변경합니다(그림 1B).</li>
	<li>10일째에 연골세포와 유사한 세포를 연골형성을 촉진하도록 제조된 Medium B(보충 표 1)로 이동합니다. 10일 동안 2일마다 매체를 교체합니다(그림 1C).</li>
	<li>증류수에 1.5% 아가로스로 각 웰을 코팅하여 96웰 세포 현탁 배양 플레이트를 미리 준비합니다. 아가로스를 끓을 때까지 전자레인지에 녹입니다(700W에서 약 60-90초). 아가로스가 액화되면 각 웰에 75μL의 아가로스를 첨가하고 RT(약 15분)에서 경화시킵니다.</li>
	<li>각 웰에 150μL의 DMEM 배지를 추가하고 최소 12시간 동안 CO2 인큐베이터에서 플레이트를 배양합니다. 알림: 준비된 플레이트는 증발을 보상하기 위해 각 웰의 배지가 보충되는 경우 37°C의 CO2 인큐베이터에서 최대 1개월 동안 보관할 수 있습니다.</li>
	<li>12일째에 연골 형성과 관련된 표현형 변화를 관찰한 후 생성된 연골 세포 유사 세포를 사용하여 스페로이드 형성을 시작합니다. 참고: 이 단계에서는 iPSC의 성공적인 연골형성 분화를 확인하기 위해 2-ΔΔCT 방법9 를 사용하여 면역세포화학(ICC) 및 정량적 중합효소 연쇄 반응(qPCR)으로 주요 연골세포 마커의 발현을 분석하는 것이 좋습니다. 6-well plate에서 75cm2 cell culture flask로 passage하는 동안 분석할 marker의 수와 일치하는 48-well plate에 세포의 일부를 파스딩할 수 있습니다. 이러한 샘플에 대해 ICC 분석을 수행하여 유전자 발현을 확인합니다.</li>
</ol>
6. 연골세포와 같은 iPSC 유래 세포에서 스페로이드 형성
<ol>
	<li>연골 세포 유사 유도체를 얻은 후, 80% confluency에서 세포를 계대시킵니다. 0.05% 트립신 용액을 사용하여 6-well 플레이트에서 세포를 분리합니다. 트립신을 비활성화하려면 동일한 부피의 DMEM + 10% FBS를 첨가한 다음 세포를 15mL 튜브로 옮기고 200 x g 에서 5분 동안 원심분리합니다.</li>
	<li>상층액을 제거하고 1mL의 배지 B에 세포를 재현탁시킨 다음 0.1% 젤라틴 용액으로 사전 코팅된 75cm2 세포 배양 플라스크로 옮깁니다(그림 1D). 세포가 단층으로서 80% 포화도에 도달하면 트립신으로 세포를 다시 분리하고 설명된 대로 배지 B에서 재현탁합니다.</li>
	<li>웰당 100,000개 세포의 밀도로 1.5% 아가로스로 코팅된 96웰 플레이트로 세포를 전달합니다. 웰당 150μL의 완전한 배지를 추가하여 배지 B에서 배양합니다(그림 1D, 3A).</li>
	<li>스페로이드가 형성될 때까지 최소 1일에서 최대 3일 동안 1.5% 아가로스로 코팅된 96웰 플레이트의 세포를 유지합니다(그림 2B). 끝부분이 잘린 1mL 피펫 팁을 사용하여 웰에서 스페로이드를 옮긴 다음 15mL 튜브로 옮깁니다. 스페로이드가 2-3분 동안 가라앉을 때까지 기다렸다가 상층액을 제거합니다.</li>
	<li>4°C로 유지되는 갓 해동된 희석되지 않은 기저막 매트릭스 용액에 스페로이드를 담그십시오. 30분 후 15mL 튜브에서 수동 침강 또는 100 x g 에서 1분 동안 부드러운 원심분리로 스페로이드를 수집합니다. 알림: 매트릭스는 2-8°C 냉장고에서 얼음으로 밤새 해동해야 합니다. 첫 번째 해동 후, 반복되는 동결-해동 주기를 피하기 위해 매트릭스의 일회용 부분 표본이 만들어집니다. 폴리프로필렌 또는 기타 냉동고 호환 튜브를 사용하여 -70°C 또는 -20°C에서 보관합니다. 제조일로부터 2년인 배치/로트의 만료 날짜에 주의하십시오.</li>
	<li>스페로이드를 미니 생물반응기로 옮기고 6mL의 Medium B를 추가합니다. 5% CO2 및 100% 습도와 70-75rpm의 교반 속도를 37°C로 설정한 CO2 인큐베이터 내부의 궤도 셰이커에 미니 생물반응기를 놓습니다(그림 1F).</li>
	<li>매체를 매주 변경하거나 산-염기 지표의 중간 고갈 또는 색상 변경에 따라 필요에 따라 변경합니다. 이렇게 하려면 스페로이드가 15mL 튜브에 중력에 의해 침전되도록 한 다음 상층액을 조심스럽게 제거합니다. 튜브에 새로운 배지 B를 추가하고 스페로이드를 미니 생물반응기로 다시 옮깁니다.</li>
</ol>

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</ol>

<table><tbody><tr><td>0.05% 트립신 용액</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25300-062</td><td></td></tr><tr><td>0.25% 트립신 용액</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25200-072</td><td></td></tr><tr><td>Advanced DMEM/F12 Eagle's medium</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12634028</td><td></td></tr><tr><td>Aggrecan Monoclonal Antibody</td><td>Invitrogen</td><td>AHP0022</td><td>Host: Mouse; 희석 : 1/500</td></tr><tr><td>아스코르브 산</td><td>시그마</td><td>A4544</td><td>50 &mu; g/mL</td></tr><tr><td>B-27 보충제</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17504044</td><td>1x 또는 2%</td></tr><tr><td>베타-메르캅토에탄올</td><td>Serva</td><td>28625</td><td>90 mM</td></tr><tr><td>BMP2</td><td>Miltenyi biotec</td><td>130-110-922</td><td>10 ng/mL</td></tr><tr><td>Chir 99021</td><td>Miltenyi biotec</td><td>130-103-926</td><td>10 &mu; M</td></tr><tr><td>COL1A1 (E6A8E) 단클론 항체</td><td>CellSignalling</td><td>39952</td><td>숙주: 토끼; 희석: 1/800</td></tr><tr><td>COL2A1 (M2139) 단클론 항체</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-52658</td><td>호스트: 마우스; 희석: 1/50</td></tr><tr><td>콜라겐분해효소 II형 용액&nbsp;</td><td>PanEco</td><td>P011-2</td><td>0.01%</td></tr><tr><td>DAPI(4',6-디아미디노-2-페닐린돌)</td><td>시그마-알드리치</td><td>D9542-5MG</td><td>1&mu; g/mL</td></tr><tr><td>DMEM 배지 글루타민</td><td>PanEco</td><td>?420이</td> 없습니까?<td></td></tr><tr><td>태아 소 혈청&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10270106</td><td>10%</td></tr><tr><td>Hanks의 솔루션&nbsp;</td><td>팬에코</td><td>?020?</td><td></td></tr><tr><td>Hybris 8 매체</td><td>PanEco</td><td>?780?/?780</td><td></td></tr><tr><td>인슐린-트랜스페린-셀레늄 용액</td><td>PanEco</td><td>?065</td><td>1x 용액의 농도는 다음과 같습니다: 인슐린: 10 &마이크로; g/mL; 트랜스페린: 5.5 &마이크로; g/mL; 셀레늄 5 ng/mL</td></tr><tr><td>L-알라닐-L-글루타민&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>35050038</td><td>2 mM</td></tr><tr><td>Matrigel Matrix</td><td>BD</td><td>354277</td><td>300 &mu; g/mL</td></tr><tr><td>페니실린-스트렙토마이신 용액</td><td>PanEco</td><td>?063?</td><td>100 U/mL</td></tr><tr><td>레티노산</td><td>Miltenyi biotec</td><td>130-117-339</td><td>10 nM</td></tr><tr><td>Rho kinase 억제제 Y27632</td><td>Miltenyi biotec</td><td>130-103-922&nbsp;</td><td>10 밀리미터미터</td></tr><tr><td>2차 항체 염소 항-마우스 IgG (H+L) 교차 흡착, Alexa Fluor 555</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td>A21422</td><td>숙주: 염소; 희석: 1/500</td></tr><tr><td>보조 항체 염소 항-토끼 IgG (H+L) 고-교차 흡착, Alexa Fluor Plus 555</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td>?32732</td><td>주인: 염소; 희석: 1/500</td></tr><tr><td>Sox9 (D8G8H) 단클론 항체</td><td>CellSignalling</td><td>82630</td><td>숙주: Rb; 희석: 1/400</td></tr><tr><td>TeSR-1 매체</td><td>STEMCELL 기술</td><td>85850</td><td></td></tr><tr><td>TGF-&beta; 1&nbsp;</td><td>Miltenyi 바이오텍</td><td>130-095-067</td><td>10ng/mL</td></tr></tbody></table>

generating spheroids from various chondrocytes using low-adhesive conditions under gravity and homemade mini-bioreactors

Generating Spheroids from Various Chondrocytes using Low-Adhesive Conditions under Gravity and Homemade Mini-Bioreactors

요약된 프로토콜은 그림 1에 설명되어 있습니다. 이 방법론은 두 가지 별개의 배양 배지를 사용하여 최소 1개월 동안 iPSC를 연골세포 스페로이드로 분화시킵니다(그림 2). 분화 과정은 iPSC가 75%-90% 포화도를 달성할 때 시작됩니다(그림 1B). 연골형성 분화의 초기 지표는 배지 A에서 배양 9-10일째 되는 날쯤에 나타나며, 세포가 연골세포의 특징적인 형태를 채택하는 것으로 표시됩니다. 10일째에 세포를 배지 B(그림 1C)로 옮기고 19일까지 분화가 완료될 때까지 배양합니다(그림 3). 이 단계에서 세포의 99%가 연골형성 마커인 아그레칸(ACAN), 콜라겐 I형(COL1A2), 콜라겐 II형(...

Cartilage repair in chronic joint diseases demands advanced cell-based therapies to regenerate damaged tissues effectively. This protocol provides a ...

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Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

활액 액체 높은 수준의 culturing 인간의 관절 chondrocytes의 3D 시스템이 설명되어 있습니다. 활액 액체는 관절 연골의 가장 자연 microenvironment을 반영하고, 쉽게 얻은하고 저장할 수 있습니다. 이 시스템은 따라서 연골 재생을 공부 및 관절염 치료를위한 심사 치료제 사용할 수 있습니다.

활액 유체에 Culturing 인간 관절 Chondrocytes을위한 3D 시스템

chondrocytes의 연골 성의 세포 외 기질의 생합성은 기계적 자극의 응용 프로그램에 의해 영향을받을 수 있습니다. 이 방법은 3D 구조와 chondrocyte 신진 대사를 유도 변화의 평가에 캡슐화 chondrocytes에 동적 압축 변종을 적용하는 기술에 대해 설명합니다.

Chondrocyte - 아가로 오스 Hydrogels의 기계적 자극

연골 복구는 충족되지 않은 의학적 도전을 나타내며 인간의 관절 연골을 엔지니어링하기 위한 세포 기반 접근 방식은 유망한 솔루션입니다. 여기에서는 3차원(3D) 생체 모방 하이드로겔을 인간 관절 연골 세포의 확장 및 성숙을 위한 이상적인 도구로 설명합니다.

관절 연골 세포 문화와 연골 생성을위한 3D 하이드로 겔 공사장 공중 발판

기계적 스트레스는 줄기세포의 연골형성 분화를 유도하여 손상된 연골 복구를 위한 잠재적인 치료법을 제공할 수 있습니다. 원심 중력(CG)을 사용하여 지방 유래 줄기세포(ASC)의 연골 분화를 유도하는 프로토콜을 제시합니다. SOX9의 CG 유도 상향 조절은 연골 형성 표현형의 발달을 초래합니다.

원심 중력에 의해 지방이 유래 줄기 세포의 연골 분화 유도

이 문서에서는 연골 세포 압축을 위한 공압 작동 미세 유체 장치를 제조하고 특성화하기 위한 자세한 방법을 제공합니다.

동적 압축으로 연골 세포 자극을 위한 미세 유체 플랫폼

우리는 세포 스페로이드를 재배 할 수있는 모터 구동 원심 미세 유체 장치를 제시합니다. 이 장치를 사용하여, 단일 또는 다중 세포 모형의 스페로이드는 높은 중력 조건 하에서 쉽게 cocultured 될 수 있었습니다.

다세포 3차원 스페로이드 생성을 위한 랩 온 어 CD 플랫폼

여기에서는 세포 현탁액을 시드하기 위해 자동화 된 피펫팅 시스템을 사용하여 지방 유래 기질 / 줄기 세포 (ASC) 구상체의 대규모 생산을 설명하므로 스페로이드 크기와 모양의 균질성을 보장합니다. 이 ASC 구상체는 3D 바이오 프린팅 접근법의 빌딩 블록으로 사용할 수 있습니다.

3D 바이오프린팅을 위한 지방유래 줄기세포 구상체의 대규모, 자동화 생산

본 프로토콜은 3D 프린팅된 스탬프와 같은 장치를 사용하여 비용 효율적으로 조직 스페로이드를 대규모로 생산하는 기술을 설명합니다.

3D 프린팅된 스탬프와 같은 장치를 통한 조직 스페로이드 생성

이 프로토콜은 인간 관절 연골에서 연골 세포, 피브로넥틴 접착 분석 유래 연골 형성 동물(FAA-CP) 및 이동 연골 형성 동물(MCP)을 분리하는 방법을 자세히 설명합니다. 여기에는 효소 분해, 피브로넥틴 부착 및 이러한 세포를 분리하고 특성화하기 위한 마이그레이션 기반 분석이 포함됩니다.

Fibronectin Adhesion and Migratory Assay를 사용한 연골세포와 연골형성세포의 분리

이 연구는 스탬프 기반 시스템을 사용하여 아가로스 주형에 마이크로웰을 생성함으로써 3D 세포 구조를 생성하는 비용 효율적이고 효율적인 방법론을 제시합니다. 이 시스템은 균일한 스페로이드/오가노이드의 형성을 촉진하여 세포 상호 작용을 개선합니다. 이 접근 방식은 실험 변동성을 줄이고 약물 테스트 및 조직 공학의 응용 분야를 지원합니다.

Novel Stamp Device를 사용한 2차원 세포 배양에서 3차원 스페로이드/오가노이드 생성

학습하세요 iPSC에서 연골세포 스페로이드를 생성하는 방법을 저부착 조건과 미니 바이오리액터를 활용하여. 이 기술은 만성 관절 질환의 연골 재생 치료에 활용됩니다.

Generating Spheroids from Various Chondrocytes using Low-Adhesive Conditions under Gravity and Homemade Mini-Bioreactors

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