Name: 진 건 글머리 기호 및 슬라이스 문화 뉴런의 Biolistic Transfection의 준비 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-02-13T11:00:00.000+00:00
Duration: 17 min 42 s
Description: 배우세요 DNA 코팅 금 입자를 준비하여 생총기법으로 해마 조각 배양 뉴런을 형질전환하는 방법을. 이 기술은 개별 뉴런을 선명하게 관찰하며 형태학 연구에 활용됩니다.

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우리는이 비디오에 제시된 전체 hippocampal 조각의 낮은 배율 이미지를 인수와 관련하여 도움이 마크 Lucanic 및 Hwai - 김정일 쳉 감사드립니다. 우리는 또한 영상과 함께 텍스트로 은닉 죄로 사라 패리 감사하고 싶습니다.

BIOLISTIC TRANSFECTION에 대한 PROTOCOL 총알 만들기 총알은 최대 6 개월 좋다지만, 2~3개월 후 transfection 효율 감소로 시작할 수 있습니다. 글머리 기호는 dessicant 알약의 존재 4 ° C에 저장해야합니다. 항상 병을 열기 전에 실내 온도에 따뜻한 총알이 저장되는 섬광의 튜브를, 보자. 시작하기 전에 준비했습니다 : <ul><li> Spermidine (0.05M) </li><li> CaCl 2 (1M) </li><li> EtOH (100 % - 고급 - 개봉 병) </li><li> Autoclaved H 2 0 </li><li> transfected 수 DN​​A </li><li> Polyvinylpyrrolidone (PVP - 20 MG / ML 주식) </li><li> 2 X 15 ML 원뿔 (2/bullet 세트) </li><li> 튜브 (X ~ 30인치 / 총알 세트 1로 절단) </li><li> 섬광 튜브 (1/bullet 세트) </li><li> 탈수 알약 </li><li> 10 ML 주사기 W / 끝에 튜브 </li></ul> 튜빙을 준비 : <ol><li> 드라이 ~ 튜브 역 W / N 2 가스 (0.4 압력) 20 분 최소의 튜브 30 인치 (약 2 인치 오른쪽 O - 링 넘어 연장). </li></ol> 골드 비즈 DNA를 Precipitating : <ol><li> microcentrifuge 관 50 μmL 전체 볼륨 (최대 50 μg 총 DNA)에 transfected 수 DN​​A 준비 </li><li> 골드 6-8 MG를 무게와 microcentrifuge 관으로 전송 </li><li> 금을 0.05M spermidine 100 μL를 추가하고 20 초에 대한 sonicate </li><li> 골드 / spermidine하는 DNA의 50 μL를 추가 </li><li> 와동 (설정 5 정도) W / 캡 오픈 </li><li> 1M CaCl 2의 현명한 100 μL를 드롭 추가 </li><li> Sonicate의 잠시 (&lt;5 초) </li><li> 온도는 실온에서 10 분 석출물 수 있도록 허용 </li><li> 간략 Sonicate </li></ol> sonication 동안 PVP 솔루션을 준비 : <ol><li> (3.5 ML 백퍼센트 EtOH로 20mg/ml PVP 주식의 7.5 μL 추가) 총알의 각 집합 15 ML 원뿔, 3.5mL 희석 PVP에서 PVP 솔루션을 희석 확인 </li></ol> EtOH와 골드 비즈를 Rinsing : <ol><li> microcentrifuge 10 초 최고 속도 골드 비즈를 스핀 다운 </li><li> 뜨는 폐기하지만, 황금 구슬 위에 액체의 소량을 유지 </li><li> 필요한 경우 1ml EtOH로 배 세척, 잠시 때마다 sonicate </li></ol> PVP 솔루션에 Resuspend 골드 / DNA : <ol><li> 3.5 ML 희석 PVP / EtOH 솔루션 200 μL의 황금 펠릿을 Resuspend </li><li> 소용돌이 resuspend에 금을 펠릿 (필요한 경우 간단히 sonicate) </li><li> 새로운 15 ML 원뿔에 금색 / PVP 솔루션의 200 μL를 전송 </li><li> 모든 금괴가 15 ML 원뿔로 전송되었습니다 때까지 한 번에 PVP 200 μL를 추가, 이런 방식으로 계속하고, 최종 볼륨 3.2 ML입니다 </li></ol> 코팅 튜브 : <ol><li> 튜브 역에서 N 2를 끄고 말린 튜브를 제거 </li><li> 10 ML의 주사기에 건조 튜빙을 첨부 </li><li> 목숨 걸고 15 ML 원뿔은 골드 / PVP 가득 흔들 </li><li> 골드 / PVP 솔루션에 튜브의 끝 부분을 넣고 거품을 피하기 위해 천천히되는주의 빨아 </li><li> 튜빙의 양쪽에서 ~ 2인치 건조 남겨주세요 </li><li> 관 여전히 주사기에 부착된과 골드 / PVP 솔루션으로 가득으로 신중하게 튜브를 다시 역에 배치 </li><li> 솔루션 앉아 튜브의 끝을 표시 </li><li> 골드는 주사기가 부착된 5 분 해결하자 </li><li> 해결 골드가 (다시 - 세척해야 않게) 남겨진 있도록 주사기를 당겨 매우 천천히 솔루션을 빨아 </li><li> 주사기를 분리 </li><li> 90 ° 회전 2 초 앉아 보자 </li><li> 180 ° 회전하여 다른 이초 앉아 보자 </li><li> 5 초위한 튜브를 회전 </li><li> 밸브가 0.4 사이 읽는 있도록 N 2 켜고 - 0.5 및 5 분 동안 건조 골드 코팅 튜빙을 스핀. </li></ol> 튜빙을 절단 : <ol><li> 튜브의 준비 - 역에서 튜브를 제거하고 상처에서 끝을 잘라. </li><li> 컷 카트리지를 잡고 튜브 헬기가 아래 표시 섬광의 병을 넣어 </li><li> 플레이스 튜브 헬기에 튜브 깨끗한 면도날로 튜브를 잘라 </li><li> 섬광의 약병에 탈수의 알약을 플레이스 </li><li> 4 스토어 카트리지 ° C </li></ol> 조직 조각 슈팅 교양 조각 촬영 때, 그것은 오염을 방지하기 위해 상대적으로 살균 기술을 채택하는 것이 중요합니다. 두 개의 서로 다른 구조를 촬영하면, 총알이 모두 세트가 동일한 카트리지 홀더에 로드할 수 있지만, 배럴 - 라이너와 화면 구성 사이에서 변경되어야한다고, 기억하십시오. 시작하기 전에 준비했습니다 : <ul><li> DNA 총알 (열기 전에 상온에 섬광 약병을 따뜻한하자) </li><li> 조직 조각 </li><li> 진 건 헬리 우스 </li><li> 유전자 총 호스와 헬륨 탱크 첨부 &lt;/ 리&gt; <li> 카트리지 홀더 </li><li> 대신에 플라스틱과 바렐 라이너는 O - 링 </li><li> 디퓨저 (수정) </li><li> 디퓨저 화면 </li><li> 집게 </li></ul> 유전자 총을 준비 : <ol><li> 사용 포셉는 카트리지 홀더에 금이 코팅된 플라스틱 카트리지를 놓습니다. </li><li> 첫째 돌려 잠금을 추진하여 유전자 총에 카트리지 홀더 플레이스 </li><li> 자물쇠 카트리지 홀더를 고정 </li><li> O - 링과 장소에 안전하게 디퓨저 화면 배럴의 라이너를 구합니다 </li><li> 유전자 총에 배럴 - 라이너를 스크류 </li></ol> 유전자 총을 교양 조각 슈팅 : <ol><li> 귀 muffs 입어 </li><li> 호스 연결 헬륨 가스 탱크에 유전자 총을 플러그 </li><li> 180 PSI에 탱크에 압력을 턴 </li><li> 디퓨저 화면에서 어떤 먼지 또는 파편을 제거하기 위해 공중에 빈 쏴. 총을 쏴하려면 먼저 방아쇠를 당긴다 후, 총 삡까지 안전 잠금 버튼을 우울. </li><li> 빈 촬영 후 인큐베이터에서 조각을 제거할 </li><li> 첫번째 구축 사전 총 </li><li> 0.5 디퓨저 화면 쏴 - 슬라이스에서 1 인치 </li><li> 우물 사이의 카트리지를 사전. </li><li> 마지막으로 잘 촬영 후 인큐베이터에 다시 조각 장소 </li><li> 헬륨 호스에서 총을 분리하기 전에 가스 릴리스 압력을 해제합니다 </li><li> 돌려서 배럴 라이너, 그리고 카트리지를 제거하고 사용 조개 </li></ol> 카트리지 홀더 및 배럴 라이너 청소 : <ol><li> 장소 카트리지, 배럴 라이너, 그리고 비눗물로 비커에 확산 화면 </li><li> 20 분 목욕 sonicator 및 sonicate에 플레이스 비커 </li><li> 모든 비누 잔류물이 제거되기 전까지는 철저히 물을 린스 </li><li> 시간 동안 70 % EtOH에서 소크 </li><li> 건조 건조 종이 타월에 소는 하룻밤 </li><li> 청소 카트리지, 배럴 라이너, 그리고 화면은 다음 후속 biolistic transfections에 활용할 수 있습니다 </li></ol> Biolistic Transfection에 대한 문제 해결 팁 Biolistic transfection 때로는 suboptimal transfection 조건이 발생할 수 있습니다. 너무 적거나 너무 많은 세포가 transfected, 너무 높거나 너무 낮은 표현 수준을 초래할 수도 있고, 일반적으로 건강에 해로운가 될 조직 조각을 일으킬 수 있습니다. 압력 폭발에서 종종 건강에 해로운 슬라이스 결과. 최적 transfected 조직 조각을 얻기 위해 몇 가지 도움말입니다. : 슬라이스 (또는 너무 많은 세포 / 슬라이스를 transfected 경우), 시도 건강에 해로운 것으로 나타날 경우 <ul><li> 증가 촬영 거리 </li><li> 가스 탱크에 압력 감소 </li><li> 골드의 크기를 감소 </li><li> 바이오 방사선 디퓨저의 중심을 절단하고 디퓨저 화면 중앙을 대체합니다. </li></ul> 너무 몇 가지 세포가 transfected있다면, 시도 : <ul><li> 촬영 거리를 감소 </li><li> 가스 탱크에 대한 압력 증가 </li><li> 골드의 양을 증가 </li><li> / 잘 조직 조각의 수를 증가 </li><li> 총신 - 라이너에 O - 링이 그대로 있는지 확인하십시오. </li></ul> 같은 촬영 있는지 확인하는 동안 transfected 모두 너무 많은 너무 몇 가지 세포와 조각을 얻을 경우 : <ul><li> 당신은 대칭 위에 잘 총을 들고있다 </li><li> 금괴는 균일 튜브의 내부 코팅입니다. (당신은 황금 라인을 받고있다면, 골드가 가라앉을 때 한 번 빠른 속도로 튜브에서 뜨는을 그릴 및 질소를 켜기 전에 금을 더 이상 회전. 반면에, 당신이 금을 줄이을 받고있는 경우, , 이것은 가능성이 총알 제작 중에 너무 많은 수분 노출로 인해됩니다 튜브가 코팅하기 전에 완전히 건조하고 피부를 상한 이상) 적시에 총알을 준비한다는 사실을 당신은 EtOH의 개봉 병을 사용하고 있는지 확인하십시오. </li></ul> transfection 효율이 최적이 보이는 경우 (# 전지 / 슬라이스를 transfected)하지만, 표현 수준이 너무 높거나 너무 낮은 것 같다 : <ul><li> 골드에 대한 비율 DNA를 조정합니다. (너무 낮은 경우 예를 들어, 황금의 크기를 유지하지만, DNA의 양을 증가시킵니다.) </li><li> 촬영 및 데이터 수집 간의 시간을 조정 </li></ul> 이중 transfection의 경우에는, 귀하의 구성 중 하나가 너무 작은 표현을 받고있다면, 확인을 줄 수있는만큼, 적절한 방식으로 두 구성의 비율을 조정하고 모두 구조가 동일한 모터 아래에 있는지 확인 이거요 발기인은 다른 밖에서 경쟁하지 않습니다.

<ol><li>Klein, T. M., Fromm, M., Weissinger, A., Tomes, D., Schaaf, S., Sletten, M., Sanford, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfer+of+foreign+genes+into+intact+maize+cells+with+high-velocity+microprojectiles%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Transfer of foreign genes into intact maize cells with high-velocity microprojectiles.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 85, 4305-4309 (1988).</li>
<li>Wellmann, H., Kaltschmidt, B., Kaltschmidt, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+protocol+for+biolistic+transfection+of+brain+slices+and+dissociated+cultured+neurons+with+a+hand-held+gene+gun%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">Optimized protocol for biolistic transfection of brain slices and dissociated cultured neurons with a hand-held gene gun.</a> J. Neurosci. Methods. 92, 55-64 (1999).</li>
<li>McAllister, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biolistic+transfection+of+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+STKE%22%5BJournal%5D)">Biolistic transfection of neurons.</a> Sci. STKE. 51, 1-13 (2000).</li>
<li>Svoboda, K., Yasuda, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+of+two-photon+excitation+microscopy+and+its+applications+to+neuroscience%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Principles of two-photon excitation microscopy and its applications to neuroscience.</a> Neuron. 50, 823-839 (2006).</li>
</ol>

Biolistic transfection은 고속 DNA 코팅 골드 입자 살아있는 조직의 폭격을 통해 세포를 transfecting의 물리적인 수단입니다. 총알이 핵의 나머지에 관해서는 입자 매개 유전자 전달에는 일반적으로 transfected 세포의 결과. 여러 transfection 방법이 존재하지만, 같은 microinjection, lipofection, 칼슘 인산염 transfection, electroporation 및 바이러스성 transfection으로 biolistic transfection은 쉽게 이러한 다른 방법을 사용하여 transfected되지 않은 세포를 transfecting위한 집중 적은 노동,하고 효율적인 대안을 제공할 수 있습니다. 세포 벽의 존재는 전부터 방법 1을 사용 transfection이 어려운 만든 이후 사실, 처음 식물의 유전자 전달을위한 기술로 개발되었습니다. 포스트 mitotic의 뉴런은 2,3를 transfect하는 악명 어려운되므로 마찬가지로, biolistics는 신경 생물학 분야에서 인기를 얻고있다. 특히, 그것은 널리 그대로 뇌 조각의 단일 뉴런의 벌금 형태를 평가하기위한 실험에 사용할 수있는 주요 기술로 인식되고 있습니다. 방법은 유전자 총을 개최 손 (; 바이오 래드 편 진 건 시스템)을 사용하여 양식 뇌 조각의 biolistic transfection을 수행하는 방법에 대한 상세하고 포괄적인 설명을 제공합니다 여기에서 설명한. 그것은 뇌 슬라이스에 걸쳐 세포의 스파스 번호 transfection을 허용하기 때문에 Biolistic transfection은 슬라이스 문화에 신경을 transfecting에 대한 기본 방법이되었다. 이러한 방법으로 각각의 뉴런은 격리 검사하실 수 있습니다. 이 기법은 특히 뇌 슬라이스의 뉴런을 transfecting 적합되기 때문에, 그것은 종종 광 산란 조직 네 안에 깊은 찬란 분류 세포의 2 광자 여기있게 시각화 이후, 2 광자 현미경과 함께 사용됩니다. 사실이 동영상을 통해 제공 하나 피라미드 뉴런의 높은 배율 이미지는 사용자 지정 기본 2 - 광자 레이저 스캐닝 현미경을 사용하여 점령했다. 결론 biolistic transfection 주변 세포가 높은 밀도의 컨텍스트 내에서 개별 세포를 transfecting의 효율적인 수단이며, 같은 찬란의 연결을 슬라이스 문화에서 개별 뉴런을 라벨에 대한 매우 유용한 입증되었습니다.

우리가 별도로 모든 제품을 나열했습니다하지만, 바이오 - 래드 (CAT # 165-2431) 위에 나열된 모든 제품에 포함되어 &quot;유전자 건 시스템 편&quot;구입에 더 경제적입니다.

진 건 글머리 기호 및 슬라이스 문화 뉴런의 biolistic transfection의 준비

Preparation of Gene Gun Bullets and Biolistic Transfection of Neurons in Slice Culture

Biolistic transfection은 고속 DNA 코팅 입자와 조직을 bombarding하여 세포를 transfecting의 물리적인 수단입니다. 우리는 DNA 코팅 총알의 초기 준비에서 유전자 총을 사용하여 organotypic 슬라이스 문화의 마지막 촬영에, 쥐 hippocampal 조각의 biolistic transfection에 대한 자세한 프로토콜을 제공합니다. 유전자 총 transfection은 뉴런을 transfecting의 효율적이고 쉬운 방법이며 찬란 조직 통에 세포의 작은 하위 집합을 라벨에 특히 유용합니다. 이 비디오에서는, 우리는 먼저 DNA와 코팅 골드 입자하는 데 필요한 단계를 설명합니다. 우리는 옆에있는 골드 / DNA 총알과 플라스틱 튜브의 내부를 선하는 방법을 보여줍니다 및 유전자 총에 로딩을위한 플라스틱 카트리지를 얻으려면이 튜브를 잘라하는 방법에 대해 설명합니다. 마지막으로, 우리는 생명 래드 취급을 보여주는 것은 유전자 총을 편, 그리고 건강하고 최적의 transfected 조직 조각을 얻기 위해 문제 해결에 대한 조언을 제공, 쥐 hippocampal 슬라이스 문화 biolistic transfection을 수행합니다.

우리는 DNA 코팅 황금 총알을 준비하는 방법을 설명하고 biolistically 교양 hippocampal 조각의 뉴런을 transfect 그러한 총알의 사용을 보여줍니다.

진 건 글머리 기호 및 슬라이스 문화 뉴런의 Biolistic Transfection의 준비

생물학적 입자 투사법(Biolistic transfection)은 고속의 DNA 코팅 입자를 조직에 충돌시켜 세포에 형질전환을 유도하는 물리적 방법입니다. 본 영상에서는 상세한...

생물학적 또는 유전자 총(gene gun) 형질전환은 DNA가 코팅된 입자를 고속으로 조직에 쏘아 세포를 형질전환시키는 물리적 방법입니다. 이 기술은 뉴런을 형질전환시키는 효율적이고 쉬운 수단이며, 특히 조직 슬라이스 내의 소수 세포만을 형질전환시키고자 할 때 유용합니다. 예를 들어, 형광 현미경을 통해 온전한 슬라이스 내의 뉴런 형태를 조사하려는 연구에 활용됩니다.Bic transfection은 transfection 되지 않은 세포들의 깨끗한 배경 속에서 개별 뉴런을 시각화하는 것을 용이하게 합니다. 본 영상에서는 DNA가 코팅된 유전자 총(gene gun) 탄환을 제작하고, 이를 이용해 장기 배양 뇌 해마 절편 배양물(organotypic hippocampal slice cultures)에 Bic transfection을 수행하는 방법을 시연합니다. 안녕하세요, Georgia Woods입니다.저는 캘리포니아 대학교 데이비스 캠퍼스의 Karen Zito 교수님 연구실에 재학 중인 대학원생입니다. 오늘은 DNA가 코팅된 불렛(bullets)을 제작하는 방법과 쥐의 해마 절편에 Bic transfection을 수행하는 방법을 시연하겠습니다. Bic transfection의 기본 단계는 첫째, transfection할 DNA로 금 입자를 코팅하고, 둘째, 이 금 입자로 플라스틱 튜브 내부를 코팅하는 것입니다.튜브를 카트리지 형태로 잘라 진 가너(gene gun)에 장전하고, 형질전환할 조직에 발사합니다. 그럼 시작하겠습니다. 형질전환을 준비하기 전에, 먼저 DNA가 코팅된 입자를 준비해야 합니다.이 과정은 transfection할 DNA 플라스미드로 1.6 micron 금 입자를 코팅하는 작업을 포함합니다. shooting 과정에서 개별 금 입자가 총알 역할을 하여 세포를 관통함으로써 transfection을 유도하게 됩니다. 따라서 먼저 transfection에 사용할 DNA를 준비해야 합니다.이상적으로는, 총 50 µL의 물 부피 내에서 불렛 한 세트당 50 µg 미만의 DNA를 사용하는 것이 좋습니다. 사용될 정확한 DNA 양은 최적의 발현 수준을 얻기 위해 각 컨스트럭트(construct)별로 실험적으로 결정해야 한다는 점을 유의하십시오. 이제 DNA 분취액이 준비되었으므로, 금 나노입자에 정자를 첨가해야 합니다.미리 무게를 잰 8 mg의 금에 정자 100 µL를 추가하고 초음파 처리합니다. 약 20초 동안 처리하며, 사용되는 시료는 정자입니다.Meine는 폴리아민으로, 금 리드에 양전하를 부여하여 음전하를 띤 DNA가 양전하를 띤 금속과 상호작용하도록 합니다. 22번째 소노(son) 이후, 50 µL의 DNA 수용액을 금에 첨가하십시오. 비드에 DNA를 첨가한 후, 100 µL의 염화칼슘을 한 방울씩 떨어뜨리며 볼텍싱하십시오. 염화칼슘은 DNA의 침전을 유도합니다.잠시 볼텍싱한 후 용액을 10분 동안 침전시킵니다. 10분간의 침전 후, 탁상 원심분리기를 사용하여 DNA와 금을 최대 속도로 30초 동안 원심분리합니다. 고속 원심분리가 끝난 후, 금 펠릿이 흡입되지 않도록 주의하며 상층액의 대부분을 피펫으로 제거합니다. 이 단계에서는 금에 침전되지 않은 DNA만을 제거하는 것입니다.그 후 금 입자를 1 mL의 신선한 에탄올로 세척하고 짧게 초음파 처리합니다. DNA가 침전되면 금 입자가 뭉치는 경향이 있는데, 가벼운 초음파 처리를 통해 이러한 금 뭉침을 해소할 수 있습니다. 다만, 과도한 초음파 처리로 인해 DNA가 절단되지 않도록 주의하십시오.금 펠렛을 다시 원심 분리하고 피펫팅을 통해 에탄올을 제거합니다. 에탄올 세척 과정을 두 번 더 반복합니다. 세 번째 에탄올 세척 후, 희석된 polyvinylpyrrolidone(PVP) 용액 200 µL를 첨가하고 초음파 처리합니다.코팅된 금을 200 µL의 희석된 PVP 용액이 이미 들어 있는 15 mil 원추형 튜브로 빠르게 옮깁니다. PVP는 금 입자가 사용된 플라스틱 튜브에 부착되도록 하는 용매입니다. 다음 단계에서는 epi 튜브에 200 µL의 PVP를 추가하여 epi 튜브에 남아 있는 금 비드의 흔적을 제거합니다.그런 다음 짧게 교반하고 15 mL 원뿔형 튜브로 옮깁니다. 모든 금이 15 mL 원뿔형 튜브로 옮겨질 때까지 이 과정을 반복합니다. 남은 PVP 용액을 옮겨 금이 3.2 mL의 PVP 에탄올 용액에 재부유되도록 합니다.이제 유전자 총에 장전될 때 유전자 총 탄환을 수용하는 데 사용될 플라스틱 튜브를 코팅할 준비가 되었습니다. 금 입자가 DNA로 코팅되었으므로, 플라스틱 튜브의 내벽을 금 입자로 채워야 합니다. 이렇게 금이 코팅된 플라스틱 튜브가 실제로 유전자 총 튜브에 장전되는 부분입니다.먼저, 튜브가 O 링 너머로 약 2인치 정도 연장되도록 자릅니다. 튜브를 튜브 준비 스테이션에 배치한 후, 유량계의 수치가 약 0.4가 되도록 압력 밸브를 돌립니다. 질소는 튜브를 건조시키기 위한 무수 분위기를 제공하므로, 튜브를 약 20분 동안 건조시킵니다.이 건조 단계는 이전 단계에서 설명한 대로 금 불렛(gold bullets)에 DNA를 코팅하는 동안 수행하는 것이 가장 좋습니다. 그렇게 하면 코팅 작업이 끝났을 때 튜브가 건조되어 바로 코팅할 준비가 될 것입니다. 튜브가 건조되고 금에 DNA 코팅이 완료되었으므로, 이제 금 비드(gold beads)를 준비합니다.금 PVP 용액을 튜빙에 채우기 전에 N two 스테이션의 전원을 끄고, 스테이션에서 건조된 튜빙을 분리하여 10 mil 시린지에 연결한 후 PVP와 금 용액을 튜빙 안으로 흡입합니다. 용액을 충분히 흔들어 섞은 뒤, 기포가 생기지 않도록 즉시 건조된 튜빙 속으로 흡입하십시오. 이때 용액이 시린지 내부로 흡입되지 않도록 주의하십시오.튜브 내부가 PVP Gold 용액으로 채워지면, 튜브를 조심스럽게 N two 스테이션에 다시 배치합니다. 금 입자가 튜브 바닥에 가라앉을 수 있도록 주사기가 연결된 상태에서 용액을 5분 동안 그대로 둡니다. 용액이 가라앉은 튜브의 끝부분을 표시합니다.용액이 가라앉은 후, 연결된 주사기를 통해 튜브 바닥에 금색 선이 보이는 것을 확인할 수 있습니다. 상층액을 매우 천천히 뽑아내되, 역세척이 일어나거나 튜브 연결이 끊어지지 않도록 주의하십시오. 이제 금이 튜브 내부 전체에 고르게 부착될 수 있도록 튜브를 회전시키며 건조시켜야 합니다.먼저, 튜빙을 90도 회전시킵니다. 2초 동안 안정화합니다. 이제 다시 180도 회전시키고, 다시 2초 동안 안정화합니다.5초 동안 회전시킨 후, 최종적으로 N2를 켜서 스테이션의 수치가 0.4에서 0.5 사이가 되도록 조절하고, 튜브가 마르도록 5분 동안 회전시킵니다. 5분이 경과하여 금 입자가 건조되었으므로, 이제 튜브를 진 건(gene gun)에 장착할 수 있는 카트리지 형태로 잘라야 합니다. 진 건의 실린더에 장착하기에 적절한 크기의 쉘(shell)을 만들기 위해 튜브를 약 0.5인치 길이의 섹션으로 자르겠습니다.셸을 수집하기 위해 씰 시뮬레이션 담즙을 커터 아래에 배치하고, 표시된 부분의 튜빙을 깨끗한 면도날로 절단하십시오. 튜빙을 튜빙 초퍼에 넣고 적절한 길이로 자릅니다. 저항이 느껴질 때까지 튜빙을 앞으로 밀어 넣은 다음 절단하십시오.튜브를 절단하여 신틸레이션 바이알에 수집한 후, 바이알 안에 건조 펠릿을 넣습니다. 펠릿은 최대 6개월까지 사용 가능하지만, 2~3개월이 지나면 트랜스펙션 효율이 감소하기 시작할 수 있습니다. 따라서 바이알에 컨스트럭트 이름과 날짜를 기입하는 것이 권장됩니다.불렛은 제작 후 즉시 사용하거나 4 °C에서 보관할 수 있습니다. 4 °C에 보관된 불렛을 사용하는 경우, 불렛이 수분을 흡수하는 것을 방지하기 위해 개봉 전 실온에서 약 15분 동안 보관 바이알을 워밍업하십시오. 이제 진 건(gene gun)을 사용하여 DNA 불렛을 쏠 준비가 되었습니다.이제 불렛(bullet) 제작이 완료되었으므로, 실제로 세포에 형질전환(transfection)을 수행할 준비가 되었습니다. BioRad Helios 유전자 총(gene gun)을 사용하여, 박리 후 5일 동안 배양한 쥐의 해마 슬라이스를 처리하겠습니다. 유전자 총은 헬륨 가스 탱크에 연결될 것입니다.건(gun)을 발사하면 탱크에서 나오는 짧은 압력이 슬라이스에 있는 금 입자를 가속시킵니다. 일반적으로 금 입자가 세포핵에 박히게 되면, 해당 세포는 형질전환됩니다.배양된 절편을 횡단하므로, 오염을 방지하기 위해 Bic transfection 전 과정에서 비교적 멸균된 기술을 사용합니다. 카트리지가 실온으로 데워지면, 시뮬레이션 바이알을 열고 금 코팅된 플라스틱 카트리지를 카트리지 홀더에 넣습니다. 그런 다음 실린더 잠금 장치를 뒤로 밀어 카트리지 홀더를 유전자 총(gene gun)에 장착합니다.이제 배럴 라이너를 건(gun)에 장착해야 합니다. 먼저, O-링이 배럴 라이너에 제대로 들어가 있는지, 디퓨저 스크린이 단단히 고정되었는지 확인하십시오. 스크린은 배럴로부터 가해지는 압력을 분산시켜 금이 분사되게 함으로써, 웰 내에 금이 더 고르게 분산되도록 하는 역할을 합니다.배럴 라이너를 유전자 총에 끝까지 돌려 끼웁니다. 두 가지 서로 다른 컨스트럭트를 쏠 때, 두 세트의 불렛을 동일한 카트리지 홀더에 적재할 수 있으나, 컨스트럭트 사이에 배럴 라이너와 스크린을 교체해야 합니다. 이제 유전자 총을 헬륨 소스에 연결할 준비가 되었습니다.진 gun을 헬륨 가스 탱크에 연결된 호스에 꽂으십시오. 딸깍 소리가 나며 고정되어야 하며, 탱크의 압력을 180 PSI로 높이십시오. 이제 gun을 발사할 준비가 되었습니다. 하지만 먼저 청력 보호구를 착용해야 하며, 디퓨저 스크린에서 먼지나 이물질을 제거하기 위해 공발사를 수행하십시오.먼저, 건(gun)에서 비프음이 들릴 때까지 안전 인터록 버튼을 누르고 트리거를 당기십시오. 이제 슬라이스를 조사할 준비가 되었습니다. 공이사를 마친 후, 인큐베이터에서 슬라이스를 꺼내십시오.해마 절편 분리 과정에서, 웰당 4개의 절편을 배치하며, 막의 중심 부근에서 2 cm 정사각형의 모서리를 형성하도록 배열합니다. 확산 스크린을 절편에서 약 0.5~1인치 거리로 두어 각 웰을 조사합니다. 형질전환된 세포는 일반적으로 컨스트럭트에 따라 1~5일 이내에 관찰할 수 있습니다.모든 웰의 촬영이 완료되면, 가스를 끄고 압력을 해제한 후 헬륨 호스에서 건(gun)을 분리하십시오. 카트리지와 사용한 쉘을 제거하십시오. 배럴 라이너를 풀고, 카트리지, 배럴 라이너 및 스크린을 비눗물에 넣어 20분 동안 초음파 세척한 후 물로 충분히 헹구고 70% ethanol에 1시간 동안 담가 두었다가, 말린 종이 타월 위에 올려두어 하룻밤 동안 건조시켜 세척할 수 있습니다.세척된 카트리지와 스크린은 이후의 생체 내 형질전환에 재사용할 수 있습니다. 이제 형질전환 결과의 일부를 살펴보겠습니다. 표준적인 해마 절편 준비 과정에서도 사용된 불렛과 절편에 따라 형질전환 효율의 범위가 상당히 넓게 나타날 수 있습니다.일반적으로, 적절하게 분리된 형질전환 뉴런을 얻기 위해서는 상대적으로 낮은 형질전환 효율이 바람직합니다. 또한, 너무 많은 세포가 형질전환되면 최적의 조건에서도 슬라이스의 전반적인 상태가 악화됩니다. 보통 슬라이스당 세포 수는 20개 미만이지만, 동일한 웰 내의 다른 슬라이스들에는 훨씬 더 많은 세포가 포함되는 경우가 많습니다.형질전환된 슬라이스 및 기타 슬라이스들은 세포 수가 더 적어지게 됩니다. 슬라이스 간 형질전환 효율의 불일치는 일반적으로 배럴에 대한 슬라이스의 배치가 대칭적이지 않았거나, 금이 튜브 주변에 고르게 코팅되지 않고 한쪽에 집중되었기 때문에 발생합니다. 너무 많은 세포가 형질전환되었다면, 시료로부터의 분사 거리를 늘리거나, 분사 압력을 낮추거나, 불렛 제작에 사용되는 금의 양을 줄이십시오.여기에서 형질전환된 CA1 피라미드 뉴런의 훌륭한 예시를 볼 수 있습니다. 이 특정 세포에서는 세포 내에 박혀 있는 금색 불렛(gold bullet)을 확인할 수 있습니다. 형질전환된 뉴런을 더 자세히 살펴보겠습니다. CA1의 경우, 때때로 슈팅(shooting)으로 인해 슬라이스의 상태가 나빠질 수 있습니다.압력 분사로 인해 조직 절편이 손상되는 경우가 많습니다. Helios 유전자 총 시스템에는 중앙에 금속 십자형 구조가 있는 디퓨저가 포함되어 있습니다. 저희는 내부의 금속 십자형 구조를 제거하고, 그 대신 금속 스크린을 사용합니다.스크린을 배럴 라이너 끝부분보다 약간 더 크게 자른 다음, 배럴 라이너 끝과 절단된 디퓨저 사이에 끼웁니다. 이러한 방식이 슬라이스의 상태를 개선한다는 것을 확인하였습니다. 또한, 최적의 슈팅 조건은 실험 준비물에 따라 달라지므로, 각기 다른 실험 준비물에 최적화하기 위해 헬륨 탱크의 압력과 샘플로부터의 슈팅 거리를 조절하십시오.마지막으로, 이중 transfection을 위해 두 가지 서로 다른 construct가 포함된 bullet을 사용하려는 경우, 두 construct가 모두 동일한 promoter 하에 있는지 확인하십시오. 그렇게 해야 하나의 promoter가 다른 promoter보다 더 우세하게 작용하는 것을 방지할 수 있습니다. 지금까지 gene gun bullet을 준비하는 방법과 BIC transfection을 사용하여 해마 절편을 transfection하는 방법을 설명해 드렸습니다.이 방법은 단독으로 이미징이 가능한 단일 뉴런의 형태학적 연구를 수행하는 데 매우 강력한 방법입니다. 이것으로 마치겠습니다. 시청해 주셔서 감사드리며, 여러분의 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.

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