크로마토그래피 앳라인(At-line) 모니터링을 사용한 mRNA 생산을 위한 체외 전사 반응 최적화(Optimization of in vitro transcription reaction for mRNA production using Chromatographic At-line monitoring)

당사는 IVT 반응 성분을 분리하는 신속한 크로마토그래피 방법을 개발했으며, NTP 소비 및 mRNA 생산을 모니터링하는 데 사용할 수 있습니다. 이 방법을 통해 IVT 반응을 최적화하고 mRNA 수율을 극대화하는 동시에 공정 불순물 형성 및 반응 비용을 최소화할 수 있습니다. 당사의 방법론은 mRNA 분야에서 선구적이었으며, IVT 반응의 분석 데이터를 결합하면 어떻게 더 높은 수율과 더 낮은 비용으로 이어질 수 있는지 보여주었습니다.

이 분야는 현재 라만 분광법과 같은 다른 인라인 공정 분석 도구를 모색하고 있지만, 크로마토그래피는 분해능과 빠른 속도로 인해 여전히 중추적인 위치를 차지하고 있습니다. 우리는 IVT 반응을 포괄적으로 최적화하기 위해 실험 소프트웨어 설계로 고처리량 분석 도구를 캡처하는 방법을 보여주었습니다. 이로 인해 보고된 모든 IVT 반응 수율이 리터당 25g으로 가장 높았습니다.

당사의 방법을 사용하면 짧은 판독 시간으로 mRNA와 NTP 농도를 동시에 모니터링할 수 있으므로 거의 실시간 IVT 모니터링에 적합합니다. mRNA 분야는 이제 mRNA의 지속적인 제조를 향해 나아가고 있으며, 물론 이러한 전환을 지원하기 위해 차세대 도구를 개발하고 있습니다. 먼저 효소를 제외한 모든 시약을 섭씨 37도에서 분당 300회전으로 설정된 열 블록에서 15분 동안 해동하고 예열합니다.

각 튜브에 지정된 체외 전사 또는 IVT 번호와 시점을 표시합니다. 시약이 해동되는 동안 2마이크로리터의 100밀리몰 EDTA를 0.5밀리리터 멸균 튜브에 피펫팅합니다. 이제 냉동실에서 효소를 꺼내 쿨러에 임시로 보관하십시오.

50 - 100 마이크로리터의 반응 혼합물을 적절한 부피의 IVT 시약과 함께 준비합니다. 모든 IVT 시약이 혼합될 때 T7 RNA 중합효소를 마지막 시약으로 추가합니다. 즉시 2마이크로리터의 IVT 혼합물을 제거하고 2마이크로리터 EDTA를 포함하는 이전에 준비된 0.5밀리리터 튜브에 피펫팅합니다.

IVT 혼합물이 포함된 반응 튜브를 열 블록에 놓고 섭씨 37도에서 배양합니다. 원하는 각 시점에서, 반응 혼합물에서 2마이크로리터의 IVT 샘플을 제거하고 EDTA가 들어있는 튜브에 피펫을 넣습니다. 크로마토그래피 분석에서 NTP의 완전한 고갈을 확인한 후 EDTA를 사용한 벌크 IVT 반응을 최종 농도 50밀리몰로 소멸합니다.

Fed-Batch IVT 반응의 경우 각 NTP와 염화마그네슘의 스톡을 혼합합니다. 반응을 설정한 후 NTP 농도가 10% 미만으로 떨어지면 벌크 IVT 반응에 적절한 양의 사료를 추가합니다. 원하는 mRNA 생산이 이루어지면 EDTA로 전체 반응을 50 밀리몰의 최종 농도로 비활성화합니다.

컬럼 컨디셔닝의 경우, 분석 전 12시간 동안 실온에서 0.1ml 분석 컬럼을 평형화합니다. 컬럼 하우징에 표시된 방향에 따라 크로마토그래피 시스템에 컬럼을 부착합니다. 그런 다음 50 컬럼 부피의 이중 증류수로 컬럼을 플러시한 다음 분당 1ml의 유속으로 50 컬럼 부피의 MPA를 플러시합니다.

그런 다음 분석 전에 MPA만 주입하는 최소 3개의 빈 샘플을 실행하여 기준선을 설정합니다. 이제 시스템 적합성 테스트 샘플 및 보정 곡선 샘플 분석을 진행합니다. 시스템 적합성 테스트를 위해 캡핑 시약 NTP, 플라스미드 DNA 템플릿 및 mRNA를 결합합니다.

이제 이동상 A를 사용하여 알려진 농도의 희석된 정제된 mRNA 샘플을 사용하여 보정 표준물질을 생성합니다.필요한 경우 모든 NTP에 대한 보정 곡선을 생성하기 위해 최종 NTP 농도가 0.5, 2, 5, 10, 15 및 20마이크로몰인 표준물을 생성합니다. 공식을 사용하여 IVT 샘플에 필요한 최소 희석을 결정합니다. 크로마토그래피 분석을 위해 희석하기 전에 퀀칭된 IVT 샘플을 볼텍스하고 스핀다운합니다.

MPA와 염화나트륨을 원뿔형 유리 바이알에 피펫팅한 다음 담금질된 IVT 샘플을 추가합니다. 준비된 샘플을 소용돌이치고 섭씨 4도로 설정된 오토샘플러에 로드합니다. 25마이크로리터의 희석된 시료를 분석 컬럼에 주입하고 각 IVT 시료에 대해 260 및 280나노미터에서 흡광도를 측정합니다.

모든 IVT 샘플의 분석을 완료한 후 시스템 적합성 테스트 표준을 다시 주입하여 시스템 안정성을 확인합니다. 빠른 앳라인 분석을 통해 시간 경과에 따른 mRNA 생산을 모니터링할 수 있습니다. 이 실험에서는 IVT 완충액 조성이 IVT 동역학에 미치는 영향을 비교했습니다.

완충액 A로 수행된 IVT는 mRNA 생산 속도가 가장 높았으며, 완충액 B와 완충액 C.IVT 반응은 Fed-Batch로 수행될 수도 있습니다. NTP의 소비를 모니터링하면 NTP와 염화마그네슘을 반응에 공급하여 농도를 조정할 수 있습니다. 사료 첨가는 IVT 반응을 희석시키기 때문에 IVT의 mRNA 농도는 각 사료 에디션에서 떨어집니다.