Name: CRISPR/Cas9 기술과 세포 계수를 결합한 조혈 줄기 및 전구 세포의 비정상 성장 관련 유전자 평가 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-05-02T12:55:00.000+00:00
Duration: 7 min 1 s
Description: 학습하세요 CRISPR/Cas9 기술과 CCK-8 세포 계수법을 결합하여 조혈 줄기 및 전구 세포의 비정상 증식 관련 유전자를 평가하는 방법을. 이 프로토콜은 백혈병 발병 기전 연구와 신약 표적 발굴에 활용됩니다.

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<ol><li>Wilkinson, A. C., Igarashi, K. J., Nakauchi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Haematopoietic+stem+cell+self-renewal+in+vivo+and+ex+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Haematopoietic stem cell self-renewal in vivo and ex vivo.</a> Nat Rev Genet. 21 (9), 541-554 (2020).</li>
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<li>Pinello, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analyzing+CRISPR+genome-editing+experiments+with+CRISPResso%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Analyzing CRISPR genome-editing experiments with CRISPResso.</a> Nat Biotechnol. 34 (7), 695-697 (2016).</li>
<li>Cai, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genome-wide+long+noncoding+RNA+CRISPRi+screen+identifies+PRANCR+as+a+novel+regulator+of+epidermal+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">A genome-wide long noncoding RNA CRISPRi screen identifies PRANCR as a novel regulator of epidermal homeostasis.</a> Genome Res. 30 (1), 22-34 (2020).</li>
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<li>Ma, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+labeling+of+genomic+loci+with+dCas9+and+engineered+sgRNAs+using+CRISPRainbow%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Multiplexed labeling of genomic loci with dCas9 and engineered sgRNAs using CRISPRainbow.</a> Nat Biotechnol. 34 (5), 528-530 (2016).</li>
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<table><tbody><tr><td>0.45 & 무; m 미세여과막</td><td>Sartoriu</td><td>16533K-1</td><td></td></tr><tr><td>1.5mL EP 튜브</td><td>LABLEAD</td><td>MCT-150-CLD-1</td><td></td></tr><tr><td>10cm 접시</td><td>Corning</td><td>430167</td><td></td></tr><tr><td>15mL 튜브</td><td>LABLEAD</td><td>LXG1500</td><td></td></tr><tr><td>1mL 멸균 주사기</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2x Accurate Taq Master Mix(dye plus)</td>콜로니 PCR용 <td>정확한 생물학</td><td>AG11010</td><td></td></tr><tr><td>50mL 튜브</td><td>LABLEAD</td><td>LXG5000</td><td></td></tr><tr><td>5-플루오로우라실</td><td>시그마</td><td>F6627-1</td><td></td></tr><tr><td>6웰 플레이트</td><td>Corning</td><td>3516</td><td></td></tr><tr><td>70 &micro; m 세포 체</td><td>Falcon&reg;</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>96웰 플레이트</td><td>Corning</td><td>3599</td><td></td></tr><tr><td>ACK 용해 완충액</td><td>Leagene</td><td>CS0001</td><td></td></tr><tr><td>한천</td><td>BIODEE</td><td>DE0010</td><td></td></tr><tr><td>암피실린</td><td>Solarbio</td><td>A8180</td><td></td></tr> PCR Thermofisher <tr><td></td><td></td><td></td>세포 계수 키트-8 Bimake B34304<td>용 Applied Biosystems 열 순환기</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>원심분리기</td><td>eppendorf</td><td>원심분리기 5810R</td><td></td></tr><tr><td>CO2 인큐베이터</td><td>Thermo SCIENTIFIC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>C11995500BT</td><td></td></tr><tr><td>DNA Clean& 농축기-5</td><td>ZYMO</td><td>D4014</td><td></td></tr><tr><td>Dneasy 혈액 및 Tissure 키트</td><td>Qiagen</td><td>69504</td><td></td></tr><tr><td>Esp3I (BsmbI)</td><td>NEB</td><td>R0580L</td><td></td></tr><tr><td>태아 소 혈청 ExCell</td><td></td><td>FSP500</td><td></td></tr><tr><td>GraphPad 프리즘 9.3</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HEK-293T</td><td>ATCC; 미국</td><td></td><td></td>버지니아</tr><tr><td>HEPEs</td><td>시그마</td><td>V900477</td><td></td></tr><tr><td>KOD-Plus-Neo</td><td>TOYOBO</td><td>KOD-401</td><td></td></tr><tr><td>lentiGuide-Puro Addgene</td><td></td><td>52963</td><td>백본 벡터</td></tr><tr><td>LSL-Cas9 마우스</td><td>모델 Animal 연구 센터 NANJING UNIVERSITY&nbsp;</td><td>T002249</td><td></td></tr><tr><td>마이크로플레이트 흡광도 분광 광도계</td><td>BIO-RAD</td><td>xMark&trade;</td><td></td></tr><tr><td>Nacl</td><td>Rhawn</td><td>R019772</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Solarbio</td><td>P1003</td><td></td></tr><tr><td>PEI</td><td>Proteintech</td><td>B600070</td><td></td></tr><tr><td>페니실린-스트렙토마이신 용액, 100x</td><td>Solarbio</td><td>P1400</td><td></td></tr><tr><td>pMD2.G 플라스미드</td><td>Addgene</td><td>12259</td><td></td></tr><tr><td>폴리브렌</td><td>비요타임</td><td>C0351</td><td></td></tr><tr><td>폴리이노신-폴리시티딜산 나트륨염</td><td>시그마</td><td>P1530</td><td></td></tr><tr><td>psPAX2</td><td>Addgene</td><td>12260</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick PCR 정제 키트&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td>재조합쥐IL-3</td><td>페프로텍</td><td>213-13-10ug</td><td></td></tr><tr><td>재조합쥐IL-6</td><td>페프로텍</td><td>216-16-2ug</td><td></td></tr><tr><td>재조합쥐SCF</td><td>페프로텍</td><td>250-03-10ug</td><td></td></tr><tr><td>일반 아가로스</td><td>BIOWEST</td><td>BY-R0100</td><td></td></tr><tr><td>새우 알칼리성 포스파타제(rSAP)</td><td>NEB</td><td>M0371S</td><td></td></tr><tr><td>SpectraMax QuickDrop 초미세 분광 광도계</td><td>분자 DIVICES</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stbl3 유능 세포</td><td>BioMed</td><td>BC108-01&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>T4 폴리뉴클레오티드 키나아제</td><td>NEB</td><td>M0201L</td><td></td></tr><tr><td>T4-리가제</td><td>Takara</td><td>2011B</td><td></td></tr><tr><td>TIANprep 신속한 미니 플라스미드 키트</td><td>TIANGEN</td><td>DP105-03</td><td></td></tr><tr><td>트리판 블루 용액</td><td>LABLEAD</td><td>C0040-100ml</td><td></td></tr><tr><td>트립신-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25200072</td><td></td></tr><tr><td>트립톤</td><td>옥소이드</td><td>LP0042</td><td></td></tr><tr><td>WEHI-CM</td><td>난징 Fuksai 생명 공학&nbsp;</td><td>CBP50079</td><td></td></tr><tr><td>효모 추출물</td><td>옥소이드</td><td>LP0021</td><td></td></tr></tbody></table>

crispr/cas9 기술과 세포 계수를 결합한 조혈 줄기 및 전구 세포의 비정상 성장 관련 유전자 평가

Evaluation of Abnormal Growth-related Genes of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells by Combining CRISPR/Cas9 Technology with Cell Counting

Trp53 knockout이 마우스 HSPC의 증식 능력에 미치는 영향 여기에서는 이 프로토콜을 보여주기 위해 Trp53 녹아웃을 예로 사용했습니다. Trp53 knockout이 마우스 HSPC의 증식 능력에 미치는 영향을 조사하기 위해 렌티바이러스 transfection을 사용하여 5-FU 처리 후 HSPC가 풍부한 Cas9 발현 골수 세포에 Trp53 sgRNA를 도입했습니다. 동시에, 관련이 없는 sgRNAs를 littermates에서 골수 세포로 transfection하여 대조군 역할을 했습니다. 그런 다음 형질주입된 세포를 0, 24, 48 및 72시간 동안 배양하고 CCK-8 분석을 사용하여 증식 능력을 평가했습니다. 실험 설계는 그림 1에 나와 있습니다. CCK-8 분석 결과, Trp53...

CRISPR/Cas9 기술과 세포 계수를 결합한 조혈 줄기 및 전구 세포의 비정상 성장 관련 유전자 평가

Hematopoietic stem cells possess the ability for long-term self-renewal and the potential to differentiate into various types of mature blood cells. ...

evaluation-abnormal-growth-related-genes-hematopoietic-stem

Research

연구

JoVE Journal

Cancer Research

암 연구

타겟된 유전자 CRISPR/Cas9를 사용 하 여 편집 크게 유전자의 생물 학적 기능에 대 한 이해를 촉진 했다. 여기, 우리가 그들의 종양 활동을 공부 하기 위하여 모델 calreticulin 돌연변이 cytokine 종속 조 혈 모 세포에서에 CRISPR/Cas9 방법론을 활용 합니다.

CRISPR/Cas9를 사용 하 여 유전자 돌연변이 Calreticulin Cytokine 종속 조 혈 모 세포에서의 종양 활동을 조사 하기 위해 편집

프로토콜에 대 한 빠른 마우스에서 유전자 장애 CRISPR/Cas9-중재 하 고 인간의 기본 조 혈 모 세포가이 문서에서 설명 하는. Cas9-sgRNA ribonucleoproteins sgRNAs 녹음 방송 생체 외에서 그리고 상업적인 Cas9를 통해 생성 된 electroporation 통해 소개 된다. 높은 편집 효율성 제한 시간 및 금융 비용으로 달성 된다.

CRISPR/Cas9에 의해 Murine 인간과 조 혈 조상 세포의 고효율 유전자 장애

이 원고에서 급성 골수성 백혈병 (AML) 세포 증식에 여러 후보 유전자의 역할의 간단 하 고 신속 하 게 조사에 대 한 클러스터 정기적으로 Interspaced 짧은 구조 반복 (CRISPR) CRISPR-Cas9-기반 방법을 설명 합니다. 병렬입니다. 이 기술은 확장성 이며 다른 암 세포 라인에 적용 될 수 있습니다.

CRISPR-Cas9-기반 경쟁 분석 실험을 사용 하 여 유전 종속성의 조사

CRISPR/sgRNA 라이브러리 질의 단백질 코딩 유전자에 적용 되었습니다. 그러나, 유전자 규칙에서 CTCF 경계의 기능을 밝히기 위해 sgRNA 라이브러리의 미개척 남아 있습니다. 여기, 우리는 HOX loci 특정 sgRNA 라이브러리 CTCF 경계 HOX loci의 기능을 명료 하 게 설명 합니다.

HOX Loci Focused CRISPR/sgRNA 라이브러리 심사 식별 중요 CTCF 경계

설명된 것은 CRISPR/Cas9 시스템에 의한 뮤린 조혈 줄기 및 전구 세포(HSPC)의 고효율 게놈 편집을 위한 프로토콜로 조혈 시스템 별 유전자 수정을 통해 마우스 모델 시스템을 신속하게 개발합니다.

질병 모델에서 조혈 세포의 연구를 위한 렌티바이러스 CRISPR/Cas9 매개 게놈 편집

미리 조립된 Cas9/가이드 RNA 리보뉴클레오단백질 복합체의 직접 전달은 조혈 세포에서 게놈 편집을 위한 빠르고 효율적인 수단입니다. 여기서, 우리는 RUNX1 인트로닉 소음기를 삭제하고 OCI-AML3 백혈병 세포에서 전사 반응을 검사하기 위해 이 접근법을 활용한다.

급성 골수성 백혈병 세포에서 CRISPR/Cas9 리보뉴클레오단백질에 의한 RUNX1 내성 소음기의 전사 적 역할 조사

본 프로토콜은 생체 내에서 유전자 편집 세포의 강력한 생착을 위한 최적화된 조혈 줄기 및 전구 세포(HSPC) 배양 절차를 설명합니다.

유전자 치료 애플리케이션을 위한 조혈 줄기 및 전구 세포의 CRISPR/Cas9 유전자 편집

조혈 줄기 및 전구 세포 (HSPC)의 체세포 돌연변이를 충실하게 모델링하는 새로운 전략은 조혈 줄기 세포 생물학 및 혈액 악성 종양을 더 잘 연구하는 데 필요합니다. 여기에서는 CRISPR/Cas9의 사용과 이중 rAAV 공여체 형질도입을 결합하여 HSPC에서 이형접합체 기능 획득 돌연변이를 모델링하는 프로토콜이 설명됩니다.

인간 조혈 줄기 및 전구 세포에서 발암성 이형접합체 기능 획득 돌연변이 공학

제시된 방법은 고효율 렌티바이러스 매개 유전자 전달 시스템을 사용하여 L2HGDH 유전자를 표적으로 하는 sgRNA를 안정적으로 발현하는 인간 배아 줄기 세포(hESC) 계통 H9에서 CRISPR 매개 유전자 knockout의 생성을 설명합니다.

CRISPR-Cas9 매개 유전자 결실은 feeder-free 조건에서 배양된 인간 만능 줄기 세포에서 발생합니다.

우리는 원발성 CAR T 세포에 대한 최적화된 CRISPR-Cas9 녹아웃 스크리닝 프로토콜을 개발했습니다. 효소 소화와 sgRNA 카세트 풀다운을 통한 gDNA 운반을 줄임으로써 PCR 인공물을 최소화하고 정확한 sgRNA 검출과 기능성 유전자 표적의 견고한 식별을 보장합니다.

CAR T 세포에서 CRISPR-Cas9 스크리닝 개선: 라이브러리 준비를 위한 정교한 방법

학습하세요 CRISPR/Cas9 기술과 CCK-8 세포 계수법을 결합하여 조혈 줄기 및 전구 세포의 비정상 증식 관련 유전자를 평가하는 방법을. 이 프로토콜은 백혈병 발병 기전 연구와 신약 표적 발굴에 활용됩니다.

CRISPR/Cas9 기술과 세포 계수를 결합한 조혈 줄기 및 전구 세포의 비정상 성장 관련 유전자 평가

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