CRISPR/Cas9 기술과 세포 계수를 결합한 조혈 줄기 및 전구 세포의 비정상 성장 관련 유전자 평가

연구 범위는 백혈병 발병기전입니다. 우리는 CCK-8 분석과 함께 CRISPR/Cas9와 결합하여 비정상적인 HSPC 증식에 중요한 유전자를 식별하고 종양 형성에서의 역할과 약물 표적으로서의 잠재력을 밝히는 것을 목표로 합니다.

CRISPR/Cas-9 기반 유전자 편집은 진핵 세포에서 유전자 녹아웃을 달성하기 위한 간단하고 효율적인 접근 방식을 제공합니다. 현재 실험 과제는 CRISPR/Cas-9 녹아웃 효율을 더욱 높이는 것입니다.

우리의 프로토콜은 Cas-9 마우스를 사용하여 골수 세포에 상담적 Cas-9 발현을 공급함으로써 SGI를 세포로 바이러스 전달하여 실험 효율성을 크게 향상시킵니다.

[발표자] 시작하려면 안락사된 실험 마우스로부터 대퇴골과 경골을 얻습니다. 무균 상태를 유지하기 위해 제거 직후 대퇴골과 경골을 층류 후드로 옮깁니다. 1밀리리터 멸균 주사기를 사용하여 2% FBS를 함유한 PBS로 골수강을 세척하여 골수 세포를 수집합니다. 골수 세포를 위아래로 30-50회 피펫팅하여 단일 세포로 분산시킵니다. 세포 혼합물을 50밀리리터 튜브로 옮기고 소용돌이치게 하여 잘 섞습니다. 10마이크로리터의 세포 현탁액을 40마이크로리터의 적혈구 용해 완충액에 넣고 얼음 위에 5분 동안 놓아 적혈구를 용해시킵니다. 그런 다음 50마이크로리터의 트리판 블루 용액을 추가합니다. 잘 섞고 생존 세포를 계산합니다. 다음으로, 세포를 섭씨 4도에서 15분 동안 800G에서 원심분리하고 상청액을 흡인합니다. 그런 다음 골수, 사전 자극 배지에서 밀리리터당 6개의 세포의 거듭제곱에 대한 1-2배 10의 농도로 세포를 재현탁합니다. 그리고 현탁액 10밀리리터를 10cm 접시에 뿌립니다. 접시를 섭씨 37도에서 24시간 동안 배양합니다. 다음날 사전 자극된 세포를 수집하려면 2% FBS를 함유한 PBS 5-10밀리리터를 추가하고 플레이트를 세게 헹굽니다. 세포를 새 튜브로 옮기고 트리판 블루를 세포에 첨가합니다. 혼합물에서 생존 세포를 계산합니다. 다음으로, 세포를 실온에서 10분 동안 800G에서 원심분리합니다. 상청액을 버린 후, 밀리리터당 6개의 세포의 거듭제곱으로 약 10의 농도로 새로 준비된 감염 용액에 세포를 다시 현탁합니다. 6웰 플레이트의 각 웰에 현탁액 4밀리리터를 시드합니다. 플레이트를 파라필름으로 밀봉하고 섭씨 32도에서 90분 동안 1,500G에서 원심분리합니다. 원심분리 후 배지를 교체하지 않고 피펫으로 세포를 부드럽게 재현탁합니다. 플레이트를 4-6시간 동안 배양합니다. 첫 번째 형질감염의 경우, 각 웰에서 약 3밀리리터의 상청액 배지를 튜브로 흡인하고 동일한 부피의 골수 사전 자극 배지를 추가합니다. 세포가 실수로 흡인된 경우 앞서 설명한 대로 원심분리 및 재현탁 단계를 반복합니다. 2차 형질감염의 경우, 다음날 각 웰에서 2-3밀리리터의 배지를 제거하고 적당량의 헤파스 및 폴리그린과 함께 같은 부피의 갓 해동된 레트로바이러스 원액을 첨가합니다. 플레이트를 섭씨 37도에서 90분 동안 1,500G에서 원심분리합니다. 원심분리 후 세포를 부드럽게 재현탁하고 4-6시간 동안 계속 배양합니다. 이제 앞에서 설명한 대로 배지를 교체하고 24시간 동안 배양합니다. 2% FBS를 함유한 PBS로 플레이트를 세척하고 세포를 수집합니다. 트리판 블루를 사용하여 생존 가능한 세포를 계수하기 전에 70마이크로미터 체를 통해 세포를 여과합니다. 다음으로, 세포를 실온에서 10분 동안 800G에서 원심분리합니다. 10% FBS와 쥐 인터루킨-3, 인터루킨-6 및 줄기 세포 인자를 포함하는 DMEM에 세포를 재현탁합니다. 약 0.5 내지 1x10을 800G에서 6세포의 거듭제곱으로 5분 동안 원심분리하고 상청액을 버린다. 게놈 DNA 추출을 위해 세포 펠릿을 섭씨 -80도에서 보관합니다. 이제 웰당 4개의 세포의 거듭제곱에 1x10을 96웰 플레이트에 추가하여 그룹당 6개의 복제 웰을 만듭니다. 그런 다음 주변 웰에 100마이크로리터의 멸균 PBS를 추가하고 0, 24, 48 및 72시간의 서로 다른 시점까지 배양합니다. 각 시점에서 배지를 흡인하고 1/10 부피의 CCK-8 용액을 포함하는 110마이크로리터의 배지를 웰에 추가합니다. 혼합물을 1시간 동안 배양합니다. 마지막으로 마이크로플레이트 분광 광도계를 사용하여 450 나노 미터에서 흡광도를 측정합니다. Trp53 녹아웃은 CCK-8 분석으로 측정한 바와 같이 24, 48 및 72시간에 대조군에 비해 마우스, 조혈 줄기 및 전구 세포의 증식 능력을 유의하게 증가시켰습니다. TRP53 편집 효율은 TIDE 분석을 사용하여 7.3%로 추정되었습니다. 그리고 차세대 시퀀싱을 통해 유전자의 다른 위치에서 발생하는 돌연변이가 밝혀졌습니다.