고배율 Live-Cell Confocal Fluorescence Microscopy를 위한 Equibiaxial Stretching Device

우리는 세포가 생리학적 및 병리학적 맥락에서 기계적 자극에 어떻게 반응하고 적응하는지 연구합니다. 이를 위해 우리는 스트레칭 장치를 사용하여 외력(이 경우 변형)을 세포에 가합니다.

우리는 세포와 세포 조직이 특정 기계적 자극에 어떻게 반응하는지, 그리고 다른 생물학적 단서에 기계적으로 반응하는 방법을 발견했습니다.

당사의 스트레칭 장치는 다양한 강성의 폴리아크릴아미드 겔에서 배양된 세포를 늘리거나 압축 실험을 수행할 수 있는 가능성을 제공하므로 다른 장치에 비해 매우 다재다능합니다.

[해설자] 시작하려면 PMMA 링을 흰색 벤치 용지 위에 놓습니다. 칼날을 사용하여 PDMS 코팅 플레이트의 가장자리를 조심스럽게 돌면 전체 둘레를 따라 깔끔하게 절단됩니다. 핀셋을 사용하여 멤브레인의 한쪽 가장자리를 들어 올린 다음 엄지손가락으로 부드럽게 벗겨 멤브레인의 절반을 플레이트에서 고르게 분리합니다. 손가락을 사용하여 PMMA 링의 전체 상단 표면에 96% 에탄올을 고르게 펴 바릅니다. 이전에 들어 올린 가장자리에서 PDMS 멤브레인을 들어 올려 플레이트에서 조심스럽게 제거합니다. 그런 다음 에탄올로 덮인 PMMA 링 위에 대칭으로 놓아 늘어나는 것을 피하면서 주름이 생기지 않도록 합니다. 그런 다음 다른 빈 PMMA 링을 가져와 장착 링 위에 놓습니다. 금속 클립을 사용하여 함께 밀봉하고 두 링 사이에 PDMS 멤브레인을 끼웁니다. 스트레치 링의 아래쪽 절반을 장착 지지대에 놓습니다. PDMS 링을 스트레치 링에 끼워 놓고 완전히 안착될 때까지 단단히 눌러 개스킷이 올바른 위치에 있는지 확인합니다. 원형 황동 추를 샘플 위에 놓습니다. 그런 다음 금속 스트레치 링의 위쪽 절반을 위에 놓고 나사 구멍을 정렬합니다. 모든 나사를 삽입하고 조입니다. 블레이드를 사용하여 링 주위의 PDMS를 부드럽게 자릅니다. 멤브레인을 먼지로부터 보호하기 위해 페트리 접시로 어셈블리를 덮으십시오. 연속 희석을 사용하여 PBS에서 0.2마이크로미터 형광 비드의 250,000 희석액 1개를 준비합니다. 그리고 PDMS 중앙에 10-30마이크로리터의 비드 용액 방울을 놓습니다. 경화 후 교란 문제를 피하기 위해 섭씨 40도 이하의 온도에서 건조시키십시오. 이제 스트레칭 장치를 현미경 스테이지 홀더에 장착하고 스트레칭 포스트를 현미경에 고정합니다. 기둥의 원형 영역에 윤활제를 넉넉하게 바르십시오. 준비된 스트레치 링을 스트레칭 포스트에 장착하고 상단 캡을 조여 어셈블리를 밀봉합니다. 그런 다음 진공 제어 상자의 후면을 진공 소스에 연결한 다음 상자의 전면을 스트레치 포스트에 연결합니다. 변형률 보정을 수행하려면 높은 비드 밀도와 사용자가 인식할 수 있는 비드 덩어리가 포함된 관심 필드를 선택합니다. 선택한 시야의 나머지 위치에 있는 이미지를 획득하고 위치를 저장합니다. 음의 20밀리바의 낮은 진공 수준에서 스트레칭을 적용하여 모든 방향으로 움직이게 합니다. 이제 Z 평면에서 다시 초점을 맞추고 스테이지를 XY 방향으로 이동하여 동일한 관심 영역을 찾고 늘어난 상태의 이미지를 획득합니다. 그런 다음 변형을 풀고 더 높은 진공 수준으로 단계를 반복합니다. 획득한 이미지를 샘플별로 정리된 폴더에 저장합니다. 이름, 스트레치 없이 획득한 레퍼런스 비드 이미지는 reference_str1 및 증가하는 진공 수준에서 스트레칭된 이미지는 stretched_str1, stretched_str2, stretched_str3 등입니다. 변형률을 정량화하려면 MATLAB을 열고 겔 변형률 코드를 로드합니다. 매개 변수를 설정한 후 부모와 실험 폴더 경로를 정의하고 코드를 실행합니다. 그런 다음 코드에서 요청한 대로 stretched_str1 연 다음 reference_str1를 엽니다. 이제 각 진공 수준에 대한 중앙값 변형률 매트릭스를 계산합니다. 최소 3개의 샘플에 대해 이 과정을 반복한 후 중앙값 변형률 매트릭스 대 진공 수준을 플로팅하여 검량선을 얻습니다. PDMS 링을 코팅하려면 자외선으로 15분 동안 멸균하십시오. 생물 안전 캐비닛 아래에서 멸균 PBS로 후드 아래의 플레이트를 헹굽니다. 플레이트를 헹구는 데 사용되는 모든 PBS를 흡인 후. 링 중앙에 100-200마이크로리터의 용액 방울을 떨어뜨립니다. PDMS 멤브레인의 아래쪽에서 영구 마커로 방울의 둘레를 그리고 배양합니다. 실험 당일, 접착 단백질을 PBS로 세척한다. 세포를 트립신화한 후 세포 계수를 진행합니다. 부착을 촉진하기 위해 표준 세포 배지로 약 20 내지 50 마이크로리터의 소량에 적절한 수의 세포를 파종하고 습도 조절이 가능한 이산화탄소 인큐베이터에서 배양합니다. 20-30분 후, 세포 위에 500마이크로리터의 배지를 부드럽게 추가하고 플레이트를 인큐베이터로 되돌려 세포가 더 퍼질 수 있도록 합니다. 단일 스트레치 릴리스 주기 및 이미징의 경우 앞에서 설명한 대로 스트레치 링을 현미경 스테이지에 장착합니다. 관심 있는 셀을 찾은 후 위치를 기록하고 미리 늘어난 셀의 이미지를 캡처합니다. 검량선을 기반으로 필요한 기질 변형률에 해당하는 원하는 진공 수준을 적용하여 셀을 늘립니다. 스트레치 셀을 찾으려면 먼저 Z 평면에 다시 초점을 맞춥니다. 그런 다음 XY 방향으로 이동하여 셀을 시야의 중앙에 배치합니다. 원하는 시간 동안 이미지를 기록합니다. 셀의 원래 위치로 이동하고 현미경의 획득 모드를 활성화하여 초점이 다시 맞춰지는 즉시 이미지 캡처가 시작되도록 합니다. 스트레치를 풀고 Z 평면에서 수동으로 빠르게 다시 초점을 맞춥니다. 필요한 시간 동안 방출된 세포의 이미지를 캡처하고 획득 전반에 걸쳐 초점을 수동으로 조정합니다. 후처리를 위해 Fiji를 열고 정지 및 변형 중에 획득한 이미지를 로드합니다. Fiji 플러그인 템플릿 일치를 사용하여 정렬할 셀 영역을 선택합니다. 교정을 통해 적용된 변형률에 대한 재현성과 제어가 보장되어 진공과 변형률 사이의 거의 선형 관계가 최대 20%까지 확인되었습니다. 방사형 변위 분석은 PDMS 멤브레인에 대한 변형의 등방성과 균질성을 입증했습니다. 살아있는 세포 스트레칭 하에서 섬유아세포 세포의 형광 이미징은 스트레치 방출 시 막 함입을 나타냈으며 이는 3-5분 이내에 재흡수되었습니다. 고정된 세포를 다시 늘리면 늘어난 상태에서 이미징이 가능해 인위적인 접힘 아티팩트를 방지할 수 있었습니다. 패턴화된 그리드가 있는 PDMS 멤브레인은 다중 모드 이미징을 용이하게 하여 형광 및 주사 전자 현미경에서 동일한 세포의 국소화를 가능하게 했습니다. 피브로넥틴으로 코팅된 부드러운 PAA 겔 위에 앉은 세포는 늘어나지 않은 세포와 비교하여 특정 주기적 스트레칭 주기에 제출될 때만 초점 유착을 형성했습니다.