네이티브 γH2A에 의한 일반적인 취약한 부위 파손 캡처. X 치프

우리의 사치는 연대 측정을 잃는 데 초점을 맞추고 있으며, 종양 재발생에서 자이브에서 일반적인 취약한 부위 불안정성의 역할에 중점을 둡니다. 치료적으로 활용될 수 있는 종양유전자 자이론 암세포에서 바이러스 이동성을 확인하려고 노력하십시오. 그렇지 않으면 이미징 및 단일 세포 공감 및 살아있는 세포 이미징과 같은 시퀀싱 기술은 질량의 게놈 불안정성에 대한 고해상도 매핑을 제공합니다.

노이즈, 유전자 조작 마우스 모델 및 CRISPR 기반 시스템을 포함한 영역 생체 내 모델로 종양유전자 게놈 불안정성의 메커니즘을 자세히 조사합니다. 우리 연구실의 장기적인 관심은 정상 세포에 대한 피해를 최소화하는 데 중점을 두고 감염된 치료를 위해 전략적으로 치료할 수 있는 암세포의 특정 약점을 식별하는 것입니다. 여기에는 정상적인 치료 기회를 발견하기 위해 유전적 및 후생유전학적 취약성을 탐색하는 것이 포함됩니다.

시작하려면 HEK 293 T 세포를 DMSO 에틸 데콜린과 하이드록시우레아로 3개의 서로 다른 플레이트에서 24시간 동안 처리합니다. 세포를 PBS로 두 번 세척한 후, 섭씨 4도에서 5분 동안 500G 4분으로 원심분리한다. 펠릿을 500마이크로리터의 새로 준비된 콜드 완충액 A에 다시 현탁시키고 얼음 위에서 5-10분 동안 배양합니다.

완전한 세포 용해를 확인하기 위해 광학 현미경으로 용해 진행을 관찰합니다. 용해되면 세포 현탁액을 섭씨 4도에서 5분 동안 500 G에서 원심분리하고, 핵 펠릿을 500 마이크로리터의 저온 완충액 A에 재현탁시킨다. 다시 원심분리하고, 5회 내지 10회 피펫팅하여 온전한 핵을 100 마이크로리터의 미세구균 뉴클레아제 완충액으로 재현탁시킨다. 미리 정해진 양의 미세코쿠스 뉴클레아제를 샘플에 즉시 첨가하십시오.

튜브를 섭씨 37도에서 5분 동안 회전 장치에 놓습니다. 즉시 튜브를 얼음으로 되돌리고 EDTA를 첨가하여 소화를 종료합니다. 와류 후 500마이크로리터의 완충액 B를 넣고 위아래로 피펫팅하여 혼합합니다.

단백질을 가용화하기 위해 튜브를 얼음 위에서 5분 동안 배양합니다. 불용성 물질을 펠릿화하려면 시료를 섭씨 4도에서 5분 동안 최대 속도로 원심분리합니다. 투명한 상청액을 천연 염색질 분획으로 표시된 새로운 1.5밀리리터 튜브로 옮깁니다.

염색질 단편화를 확인하려면 상청액 10마이크로리터를 새로운 1.5밀리리터 튜브에 분취합니다. 상청액을 증류수 20마이크로리터 및 페놀 클로로포름 이소아밀 알코올 30마이크로리터와 혼합합니다. 격렬한 소용돌이 후, 섭씨 4도에서 10분 동안 20, 000 G에서 튜브를 원심분리하고 3개의 뚜렷한 층을 관찰합니다: 투명한 최상층, 흰색 중간층 및 노란색 바닥층.

DNA가 포함된 상부 수성 상 20마이크로리터를 새 튜브로 조심스럽게 옮깁니다. 정제된 DNA를 1.5% 아가로스 겔에서 100볼트에서 30분 동안 분리합니다. 분해 패턴을 시각화하여 염색질 단편의 크기가 주로 200에서 1, 000 염기쌍 사이인지 확인합니다.

180마이크로리터의 용출 완충액이 들어 있는 20마이크로리터의 소화된 염색질을 각 튜브로 옮깁니다. 튜브에 입력 샘플로 라벨을 붙이고 섭씨 영하 20도에서 보관합니다. 염색질 면역침전 또는 칩을 위해 400마이크로리터의 소화된 염색질을 다른 1.5밀리리터 튜브에 추가합니다.

감마 H2 AX 항체를 DMSO 처리, 에틸 데콜린 처리 및 하이드록시우레아 처리 샘플로 옮깁니다. 튜브를 섭씨 4도의 회전 장치에 5시간 동안 또는 바람직하게는 밤새 놓습니다. 한편, 넓은 오리피스 팁을 사용하여 칩 등급 자성 단백질 AG 비드 100마이크로리터를 새로운 1.5밀리리터 튜브에 분취합니다.

튜브를 마그네틱 스탠드에 1분 동안 놓은 다음 액체를 조심스럽게 버립니다. 다음으로, 0.5% BSA를 함유한 PBS 1밀리리터에 비드를 다시 현탁합니다. 튜브를 섭씨 4도에서 4시간 동안 돌립니다.

튜브를 마그네틱 스탠드에 다시 1분 동안 놓고 상청액을 버립니다. 두 번째 세척 후, 사전 코딩된 비드를 100마이크로리터의 완충액 B에 재현탁합니다. 각 칩 샘플 튜브에 사전 코딩된 마그네틱 비드 현탁액 25마이크로리터를 추가합니다. 튜브를 섭씨 4도에서 2시간 동안 회전시킨 다음 칩 튜브를 마그네틱 스탠드에 놓고 비드가 튜브 측면에 부착되고 용액이 투명해질 때까지 기다립니다.

자기 구슬을 방해하지 않고 투명한 상청액을 버립니다. 비드를 1밀리리터의 세척 완충액에 재현탁하고 섭씨 4도에서 10분 동안 회전시킵니다. 튜브를 마그네틱 스탠드에 다시 놓고 용액이 투명해질 때까지 기다렸다가 세척 완충액을 버립니다.

최종 세척 후 튜브를 섭씨 4도에서 30초 동안 400G에서 잠시 원심분리하여 잔류 액체를 제거합니다. 튜브를 마그네틱 스탠드에 다시 놓고 튜브 바닥에 남아 있는 액체를 조심스럽게 제거합니다. 칩 항체 풀다운 효율을 확인한 후 웨스턴 블롯을 사용하여 나머지 칩 샘플 각각에 50마이크로리터의 용출 완충액을 추가합니다.

튜브를 Therma 믹서에 놓고 실온에서 15분 동안 흔듭니다. 튜브를 마그네틱 홀더에 1분 동안 놓고 엘루이트를 새 튜브에 모으십시오. 각 칩 용출 샘플에 100마이크로리터의 용출 완충액을 추가하고, 각 입력 샘플에 180마이크로리터의 용출 완충액을 추가합니다.

그런 다음 각 샘플에 200마이크로리터의 페놀 클로로포름 이소아밀 알코올을 첨가하고 튜브를 세게 소용돌이쳐 혼합합니다. 샘플을 원심분리한 후, 상부 수성층을 19마이크로리터의 3몰 아세트산나트륨과 2마이크로리터의 글리코겐 용액이 들어 있는 튜브로 조심스럽게 옮깁니다. 튜브를 소용돌이치게 하여 혼합합니다.

각 샘플에 500마이크로리터의 100% 에탄올을 첨가하고 완전히 소용돌이치십시오. 튜브를 섭씨 영하 20도에서 2시간 동안 또는 밤새 두어 DNA를 침전시킵니다. 그런 다음 상청액을 버리기 전에 튜브를 원심분리하고 펠릿을 70% 에탄올 1밀리리터에 다시 현탁시킵니다.

원심분리에 의해 잔류 에탄올이 제거되면 DNA 펠릿을 2-3분 동안 자연 건조시킨 후 400마이크로리터의 TE 완충액에 다시 현탁합니다. 더 높은 농도의 미세코쿠스 뉴클레아제는 염색질의 더 광범위한 소화로 이어져 단핵소체 단편이 우세하게 되었습니다. 대조적으로, 낮은 미세코쿠스 뉴클레아제 농도에서는 대부분의 염색질 단편이 더 컸으며 종종 1kg 염기를 초과했습니다.

감마 H2 AX 수준은 천연 칩 및 가교 칩 모두에 대한 입력 샘플에서 표시된 바와 같이 DMSO 처리된 대조군에 비해 에틸 데콜린으로 처리된 복제 스트레스 세포에서 유의하게 상승했습니다.