브릴루앵 분광법을 이용한 구체의 기계적 매핑

우리는 브릴루앵 분광법을 사용하여 비침습적으로 세포 역학을 평가하여 질병 진행에서 기계생물학의 역할을 이해하고 있습니다. 브릴루앵 분광법과 같은 비침습적 기술을 통해 시료를 교란하지 않으면서 3차원에서 역학을 특성화할 수 있습니다. 우선, 각 웰에 500마이크로리터의 부착 방지 세척액을 전처리하여 각 웰에 첨가하세요.

플레이트를 1,300g에서 실온에서 5분간 원심분리합니다. 기포를 제거한 후, 웰에서 부착 방지 세척액을 제거하세요. 다음으로 각 웰에 PBS를 1밀리리터 첨가하고 완전히 흡입합니다.

PBS 세척을 반복한 후, 실험 설계에 따라 구형당 세포 수와 겔당 구형 수를 결정합니다. 세포를 펠릿으로 넣고 보충된 DMEM 1밀리리터에 재현탁하세요. 그 다음 이 셀 현탁액 1밀리리터를 마이크로웰 플레이트의 한 웰에 넣고 잘 섞습니다.

플레이트를 100g 원심분리기로 3분간 실온에서 보관하세요. 마이크로웰 플레이트를 현미경으로 관찰하여 세포 분포가 고르고 웰 바닥에 자리 잡았는지 확인해 보세요. 세포를 37도 섭씨에서 5% 이산화탄소와 함께 24시간 배양하여 구형 형성을 돕습니다.

구형을 수확하려면 배양지를 부드럽고 천천히 제거하면서 구상체를 방해하지 않는 것이 중요합니다. PBS/FBS 코팅된 피펫 팁을 잘라 입구를 넓히고, 각 웰에 500마이크로리터의 PBS를 추가해 구체를 분리하세요. 구형이 담긴 PBS를 튜브에 모으세요.

그 후 96웰 플레이트의 한 웰에 50마이크로리터의 구형 현탁액을 옮깁니다. 세기를 돕기 위해 영구 마커로 우물 바닥에 십자가를 그려 현미경으로 이 부피에 있는 구형 개수를 세어보세요. 이 방정식을 사용해 구형 총 수를 계산하세요.

SpectraLok 소프트웨어를 열고 모든 연결된 장치가 감지될 때까지 기다리세요. 그 다음 분광기 카메라를 선택하세요. 아크릴 큐브를 현미경 샘플 홀더에 설치하고, 투명한 면이 대물렌즈를 향하게 하세요.

대물렌즈를 최대한 낮추고 그 아래 큐브를 중앙에 맞추세요. 현미경의 광학 경로가 분광기 카메라가 노출되도록 설정하려면 로터리 포트 셀렉터를 돌려 SpectraLok 카메라 창을 L.In 고, 센서 노출 시간을 500밀리초, 소프트웨어 게인을 100으로 설정하세요. 캡처 버튼을 누르고 천천히 대물렌즈를 위로 움직입니다.

렌즈를 계속 들어 올리면 브릴루앵 피크가 보이고 강도가 안정되어 초점 지점이 아크릴 큐브 내에 위치함을 나타냅니다. 이제 펌프 킬러, 즉 PK 제어 창을 열어. 가장 밝은 브릴루앵 명령 중 하나를 확대하여 압력 작동기 위치를 100마이크로미터 단위로 조절하여 Move rel을 클릭해 레일리 피크 강도를 최소화할 수 있습니다.

레일리 신호가 증가하면 리버스를 눌러 조정 방향을 변경하세요. 레일리 피크 강도가 감소하면 에탈론 압력을 10마이크로미터 단위로 미세 조정합니다. 카메라 창에서 브릴루앵 주문 중 하나를 확대하세요.

S 키를 눌러 LUT가 카메라 이미지에 적용되는 줄무늬를 시각화하세요. 설정 창을 열고 빠른 보정을 눌러 스트라이프의 최적의 수평 오프셋을 자동으로 재계산하세요. 스트라이프 정렬을 확인한 후, 펌프 킬러에서 분광기로 빛을 최대한 결합할 수 있도록 콜리메이터 렌즈 축을 조정합니다.

그 다음 스펙트럼 창을 열고 '언래핑'을 클릭하면 스펙트럼을 불러옵니다. 균질 아크릴 큐브에서는 레일리 신호를 완전히 억제하는 것을 목표로 하고 브릴루앵 신호가 명확히 보일 때까지 조정합니다. 최적화된 매개변수를 저장하려면 '모두 새로고침'을 클릭한 후 PK 제어 창에서 '모두 저장'을 선택하세요.

마지막으로, 메인 창에서 파일 I/O 섹션에서 저장을 클릭해 구성을 저장하세요. 스캔 소프트웨어를 열고, 아크릴 큐브 대신 하이드로겔 구형 샘플이 담긴 유리 바닥 페트리 접시를 설치합니다. 페트리 접시 뚜껑을 떼고, 젤이 잠길 수 있을 만큼 충분한 매체를 넣은 뒤, 젤이 움직이지 않도록 덮개를 덮어주세요.

먼저 레이저 빔을 차단해서 구형체를 찾아라. 현미경 광학 경로를 접안렌즈로 전환하고 백색광 조명을 켜세요. 조이스틱을 사용해 샘플 단계를 수동으로 제어하여 구형을 찾아 초점을 맞추세요.

구체의 밝은 영역 이미지를 획득하고 제어 휠을 회전시켜 조명 밝기를 조정합니다. 광학 경로를 R으로 전환해 현미경 카메라를 노출시키고, 필요한 노출 시간을 설정하세요. 다음으로, 현미경 포트를 L로 설정하고 레이저가 가려진 배경을 캡처합니다.

레이저의 차단을 해제하고, 원하는 신호 대 잡음비에 따라 200밀리초에서 500밀리초 사이의 노출 시간을 선택합니다. 포장되지 않은 스펙트럼 중에서 브릴루앵 피크 적합 범위를 선택하세요. 임계값을 브릴루앵 피크 강도의 약 절반으로 조정하고, 임계값 이하의 진폭을 가진 브릴루앵 피크는 제외합니다.

모든 확인된 브릴루앵 피크 쌍에 따라 레이저에 파장 보정을 적용합니다. 마지막으로, 스캔 폭과 스텝 크기를 조정하여 래스터 스캔 기하학을 선택한 후 스캔을 시작하여 측정을 기록하세요. 하이드로겔에 내장된 중간엽 줄기세포 구상의 대표 이미지에서는 브릴루앵 이동과 브릴루앵 선폭 맵, 그리고 이에 대응하는 밝기장, 핵, 액틴 필라멘트 형광 이미지가 뚜렷하게 나타났습니다.

저해상도 브릴루앵 주파수 이동 지도는 밝은 필드 이미지에서 수작업으로 따라 그린 윤곽을 바탕으로 젤 영역과 구형 영역으로 분할되었습니다. 다운샘플링으로 인한 모호한 픽셀은 분석에서 제외하고, 젤 및 구형 영역에 대한 명확한 이진 마스크를 만들어 BFS 값을 추출하였습니다. 고해상도 및 저해상도 BFS 지도 비교 결과, 코어 샘플링이 고해상도 스캔과 비교되는 평균 BFS 값을 제공함으로써 구형 벌크 역학의 일관된 측정을 나타냈습니다.

우리 프로토콜은 기계생물학과 관련된 다양한 질병을 연구할 수 있는 플랫폼을 제공할 것입니다. 세포 역학적 특성과 상관관계가 있는 브릴루앵 이동 변화가 질병 진행 단계를 나타내는 효과적인 지표가 될지 지켜보는 것이 흥미로울 것입니다. 약물 치료가 질병 진행을 모방하는 시간 척도에서 구형 역학에 미치는 영향을 평가할 것입니다.