Human BAMBI^highMFGE8^high Umbilical Cord Derived Mesenchymal Stromal Cells의 분리

이질적인 인간 UC-MSC를 구성하는 세 가지 주요 하위 그룹 중 하나인 BAMBI^높은MFGE8^높은 MSC의 분리는 특정 질병에 대한 임상 효능을 개선하기 위한 향후 적용을 위해 이 하위 유형의 특성과 기능을 완전히 이해하는 데 도움이 됩니다. 여기에서는 BAMBI^highMFGE8^high UC-MSC를 분류하는 방법을 제시합니다.

우리의 범위는 인간 UC-MSC의 특정 하위 그룹을 분리하고 단일 세포 전사체 인자에 따라 기본 특성을 분석하는 것입니다. 우리는 서로 다른 UC-MSC 하위 모집단에 대한 뚜렷한 특성과 기능에 대해 대답하려고 노력하고 있습니다. 우리 분야에서 가장 최근의 발전은 주로 단일 세포 RNA 염기서열 분석을 사용하여 혼합된 MSC 집단의 이질성을 발견한 것입니다.

우리는 BAMBI high MFGE8 high cell을 포함하여 human UC-MSC 내에서 3개의 하위 집단을 식별했습니다. 이 하위 그룹은 루푸스 신염에서 뚜렷한 표현형, 독특한 전사체 프로필, 제한된 지방 생성 잠재력 및 감소된 면역 억제 활성을 나타냅니다. 이러한 발견은 UC-MSC에 대한 이해를 증진시키고 특정 질병을 치료하기 위한 최적의 하위 그룹을 선택하는 데 도움이 됩니다.

우리는 BAMBI high MFGE8 high UC-MSCs뿐만 아니라 다른 두 하위 그룹의 실제 기능, 특히 다른 질병을 치료하는 데 있어 그들의 역할을 이해하기 위한 길을 닦고 있습니다. 우리는 여러 면역 매개 질병에 대한 인간 UC-MSC 하위 그룹의 적용을 시작하고 이러한 질병을 치료하는 데 있어 분자 메커니즘을 탐구하는 데 계속 집중할 것입니다. BAMBI high MFGE8 high UC-MSC를 분리하기 위해 UC-MSC를 완전한 DMEM에서 6개 세포의 거듭제곱에 약 5-10배 밀도로 배양합니다.

0.5 밀리몰 EDTA를 5분 동안 첨가하여 세포를 해리합니다. 그런 다음 완전한 DMEM을 추가하고 세포 현탁액을 15ml 원뿔형 튜브로 옮깁니다. 세포 현탁액을 위아래로 여러 번 피펫팅하여 단일 세포 현탁액을 준비합니다.

10마이크로리터의 세포 현탁액을 복용합니다. 혈구계를 사용하여 세포를 세고 수확된 총 세포 수를 계산합니다. 계수 후 300G에서 필요한 수의 세포를 5분 동안 원심분리합니다.

펠릿을 1 밀리리터의 완전한 매체에 재현탁시켜 5-10 곱하기 10의 농도를 밀리리터당 6 셀의 힘으로 달성하고 튜브를 얼음 위에 놓습니다. 다음으로, 수확된 세포를 4개의 1.5ml 마이크로 원심분리기 튜브로 나눕니다. 1 - 100 희석으로 1차 항체를 MFGE8 및 BAMBI 튜브에 추가합니다.

내용물을 철저히 혼합하고 실온에서 15분 동안 세포를 배양합니다. 배양 후 PBS를 첨가하여 라벨링된 세포를 세척합니다. 300G에서 튜브를 5분 동안 원심분리하고 상층액을 버리고 펠릿을 1ml의 완전한 배지에 다시 현탁시킵니다.

conjugated fluorescent secondary antibody를 1 - 1, 000 dilution으로 재현 유탁 세포에 첨가합니다. 철저히 섞고 튜브를 실온에서 어두운 곳에서 4 15 분 동안 배양합니다. 배양 후 PBS와 원심분리기를 첨가하여 라벨링된 세포를 세척합니다.

펠릿을 500마이크로리터의 완전한 매체에 재현탁시키고 70마이크로미터 셀 스트레이너를 통해 여과하여 덩어리와 파편을 제거합니다. 유세포 분석을 위해 여과액을 15 millil 튜브로 옮깁니다. 항체를 추가하지 않고 blank cell tube를 negative control로 실행합니다.

유세포분석기의 전방 산란 및 측면 산란 설정을 조정하여 염색되지 않은 집단에 대한 게이팅 척도를 설정합니다. 그런 다음 단일 항체 레이블이 지정된 MFGE8 및 BAMBI를 게이팅 컨트롤로 실행하여 플롯에서 양성이 시작되는 위치를 확인합니다. 실험용 샘플 튜브를 실행하여 BAMBI high MFEG8 high cell population을 분류하고 분류된 cell을 수집합니다.

분류된 MSC를 24웰 플레이트에 플레이트화하고 섭씨 37도와 5% 이산화탄소에서 세포를 배양합니다. 분류된 세포가 두 개의 계대를 통해 성장하면 유세포 분석을 수행하여 분류된 집단의 순도를 확인합니다. 배양된 UC-MSC는 CD44, CD73, CD90 및 CD105 발현에 대해 강하게 양성이었고 CD14, CD34, CD45, CD79 및 HLA DR 발현에 대해 음성이었습니다.

BAMBI 높은 MFEG8 높은 MSC는 배양된 인간 UC-MSC에서 분류되었으며, 이들의 높은 BAMBI 및 MFEG8 발현 수준은 3-4개의 계대를 통해 지속되는 것을 확인했습니다. BAMBI 높은 MFEG8 높은 MSC의 빈도는 공여체 및 해리 방법에 따라 달랐습니다.