Name: 암 면역 요법을 위해 mRNA를 사용하여 일시적인 키메라 항원 수용체 T 세포를 생성하는 비바이러스 접근법 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-02-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 56 s
Description: 학습하세요 비바이러스 mRNA 전기천공법을 사용하여 일시적 CAR T 세포를 생성하고 암 면역 요법에서 세포독성 기능을 평가하는 방법을. 이 기술은 바이러스 벡터 없이 안전하고 비용 효율적인 CAR T 세포 치료를 가능하게 합니다.

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<table><tbody><tr><td>7-AAD 생존 염료&nbsp;</td><td>Biolegend</td><td>420404</td><td></td></tr><tr><td>ACEA Novocyte 유세포 분석기</td><td>Agilent</td><td>NovoCyte 3000</td><td></td></tr><tr><td>AIM-V 매체</td><td>Gibco</td><td>12055083</td><td></td></tr><tr><td>APC 염소 항 인간 IgG F (ab') 2 항체</td><td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td><td>109-136-097</td><td></td></tr><tr><td>BglII 제한 효소</td><td>New England BioLabs (NEB)</td> <td>R0144L</td><td></td></tr><tr><td>3&acute;-O-Me-m7G(5')ppp(5')G RNA 캡 구조 아날로그</td><td>NEB</td><td>S1411S</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, 고포도</td>당 <td>Gibco</td><td>11965092</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28 beads</td><td>Gibco</td><td>11131D</td><td></td></tr><tr><td>E-Plate 96</td><td>Agilent</td><td>5232376001</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Sigma</td><td>459844-4L</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Lonza.com</td><td>14-503F</td><td></td></tr><tr><td>HiScribe SP6 RNA 합성 키트</td><td>New England BioLabs (NEB)</td><td>E2070S</td><td></td></tr><tr><td>인간 IL-2 재조합 단백질</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Millennium RNA 마커</td><td>Invitrogen</td><td>AM7150</td><td></td></tr><tr><td>Monarch RNA Cleanup Kit (500 &mu; g)</td><td>NEB</td><td>T2050L</td><td></td></tr><tr><td>N1-Methylpseudo-UTP</td><td>Trilink</td><td>N-1081-10</td><td></td></tr><tr><td>네온 형질 주입 기기</td><td>Invitrogen</td><td>MPK5000</td><td></td></tr><tr><td>Neon 형질 주입 시스템 100-&mu; L 키트</td><td>Invitrogen</td><td>MPK10096</td><td></td></tr><tr><td>페니실린-스트렙토마이신(10000 U/mL)</td><td>Gibco</td><td>14-503F</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 배지</td><td>Gibco</td><td>11875135</td><td></td></tr><tr><td>트립신-EDTA(0.05%), 페놀 레드</td><td>Gibco</td><td>25300120</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure 페놀:클로로포름:이소아밀 알코올(25:24:1, v/v)</td><td>인비트로젠</td><td>15593049</td><td></td></tr><tr><td>xCELLigence 실시간 세포 분석(RTCA) 기기</td><td>Agilent</td><td>RTCA MP</td><td></td></tr><tr><td>ZymoPURE II Plasmid Midiprep Kit</td><td>Zymo Research</td><td>D4201</td><td></td></tr></tbody></table>

암 면역 요법을 위해 mrna를 사용하여 일시적인 키메라 항원 수용체 t 세포를 생성하는 비바이러스 접근법

A Nonviral Approach to Generate Transient Chimeric Antigen Receptor T Cells Using mRNA for Cancer Immunotherapy

인간화 항-HER2 마우스 단일클론항체(mAb) 4D547, 막관통 영역, 세포내 4-1BB 공동 자극 도메인과 CD3ζ 활성화 도메인(CD3ζ 활성화 도메인)에서 유래한 scFv를 포함하는 2세대 HER2 표적 CAR을 구축했습니다(그림 1A). CAR을 암호화하는 DNA 염기서열에는 CAR mRNA의 in vitro 전사를 유도하기 위한 5' SP6 promoter가 포함되어 있습니다(그림 1B). CAR mRNA의 길이는 약 2kb였으며, 이는 겔 전기영동에 의해 검증되었습니다(그림 1C).
그런 다음 CAR mRNA를 상기한 절차에 따라 전기천공법에 의해 활성화된 T 세포로 형질주입했습니다. 전기천공법 하루 후, 세포의 50% 이상이 CAR을 발현한 반면,...

암 면역 요법을 위해 mRNA를 사용하여 일시적인 키메라 항원 수용체 T 세포를 생성하는 비바이러스 접근법

Chimeric antigen receptor (CAR) T cell therapy has emerged as a pioneering cancer treatment, achieving unprecedented success in treating certain ...

a-nonviral-approach-to-generate-transient-chimeric-antigen-receptor-t

Research

연구

JoVE Journal

Cancer Research

암 연구

이 비디오는 키메라 항원 수용체(CAR) T 세포를 생체 외에서 제조하는 기술을 보여줍니다. 인간 T 세포는 인터루킨-2(IL-2)가 보충된 배지와 함께 항-CD3 및 항-CD28 항체로 코팅된 자기 비드로 배양되어 T 세포의 활성화 및 증식을 유도합니다. 형질전환 렌티바이러스 벡터가 도입되어 형질전환 RNA가 숙주 게놈에 통합되고 전이유전자를 발현할 수 있습니다. 그 결과 형질도입된 T 세포가 표면에서 키메라 항원 수용체(CAR)를 발현합니다. T 세포는 CAR 발현 및 동결 보존을 평가하기 위해 정의된 시점에 수확됩니다.

키메라 항원 수용체 T 세포를 제조하기 위한 생체 외 기술

이 비디오는 종양 항원 특이적 키메라 항원 수용체(CAR) T 세포의 생체 외 생성 기술을 보여줍니다. 형질전환 RNA를 운반하는 레트로바이러스 벡터는 인터루킨-2가 보충된 배지에서 비장 세포와 혼합되어 T 세포의 생존과 증식을 촉진합니다. 그런 다음 혼합물을 재조합 인간 피브로넥틴 단편으로 코팅된 플레이트로 옮기고 원심분리하여 바이러스와 세포의 융합을 촉진함으로써 RNA가 숙주 게놈에 통합되고 종양 항원을 표적으로 하는 표면 결합 CAR을 생산할 수 있도록 합니다.

종양 특이적 키메라 항원 수용체 T 세포를 생성하기 위한 생체 외 기술

이 동영상은 레트로바이러스 형질도입을 통해 항원 특이적 키메라 항원 수용체(CAR) T 세포를 생성하는 기술을 보여줍니다. 활성화된 쥐 CD8+ T 세포를 재조합 피브로넥틴 단편으로 코팅된 마이크로웰 플레이트에 첨가합니다. 그런 다음 항원 특이적 키메라 항원 수용체(CAR)를 인코딩하는 형질전환 RNA를 포함하는 레트로바이러스 벡터를 도입하고 플레이트를 원심분리하여 형질도입을 용이하게 합니다. 배양 후, 형질도입된 세포는 표면에 항원 특이적 CAR을 발현합니다.

항원 특이적 CAR T 세포 생성 기술

단일 셀 쌍 인간의 TCR 알파와 베타 체인 시퀀싱과 현재 프로토콜 결합 유선형 retroviral 벡터 생체 외에서 그리고 vivo에서 TCR 식와 호환의 세대.

단일 셀 TCR 고립과 Retroviral 벡터 생체 외에서 의 생성과 Vivo에서 표현의 인간의 TCRs 간소화

우리는 안정적으로 키메라 항원 수용체 (CAR) T 세포를 생성하고 시험관 내 및 생체 내에서 그들의 분화 및 기능을 테스트하는 접근 방식을 설명합니다.

입양 면역 요법을 위한 키메라 항원 수용체 (CAR) T 세포 제조

이 프로토콜은 임상적으로 이용가능한 플랫폼으로 생체내에서 키메라 항원 수용체를 발현하도록 유전적으로 조작된 T 세포를 비침습적으로 추적하는 방법론을 기술한다.

키메라 항원 수용체 T 세포의 동적 이미징 [18F]테트라플루오로보레이트 양전자 방출 단층 촬영/컴퓨터 단층 촬영

이 기사에서는 임상용 키메라 항원 수용체 T 세포의 제조 공정, 특히 T 세포의 바이러스 transduction 및 배양을 수행할 수 있는 자동 세포 프로세서를 사용하는 공정에 대해 자세히 설명합니다. 우리는 권장 사항을 제공하고 초기 단계 임상 시험의 프로세스 개발 및 구현 중에 고려해야 할 함정을 설명합니다.

자동화된 세포 프로세서에서 키메라 항원 수용체 T 세포 제조

이 프로토콜은 레트로바이러스 벡터 생산과 쥐 T 세포 transduction을 간소화하여 마우스 CAR-T 세포의 효율적인 생성을 촉진합니다.

Murine Chimeric Antigen Receptor (CAR)-T cell의 효율적인 생성

이 프로토콜은 인간 키메라 항원 수용체 조절 T 세포(CAR Tregs)를 생성하고 테스트하기 위한 간소화된 워크플로우를 제공합니다.

인간 키메라 항원 수용체 조절 T 세포의 생성

CRISPR/Cas9 기술을 사용하여 homology-mediated end joining (HMEJ) DNA repair pathway를 통해 1차 인간 T 세포에서 큰 multicistronic 구조체의 고효율 표적 knock-in을 달성하기 위한 자세한 프로토콜이 제공됩니다. 이 cGMP 적응 프로토콜로 조작된 T 세포는 우수한 세포 증식, 세포 독성 및 사이토카인 생산을 유지합니다.

대형 DNA 주형의 상동성 매개 말단 결합을 통한 일차 인간 T 세포의 비바이러스 공학

이 프로토콜은 mRNA 전기천공에 의한 일차 T 세포의 분리, 활성화, 증식, 일시적 형질전환 등 원차 T 세포 배양의 필수 단계를 설명합니다. 또한, 표현형, 활성화 마커, 생존 가능성 및 키메라 항원 수용체(CAR) 발현의 유동 세포 분석을 위한 워크플로우 및 항체 패널도 제안됩니다.

1차 인간 T 세포의 분리, 배양 및 일시적 형질인화를 통해 키메라 항원 수용체(CAR) T 세포를 생성하는 방법

학습하세요 비바이러스 mRNA 전기천공법을 사용하여 일시적 CAR T 세포를 생성하고 암 면역 요법에서 세포독성 기능을 평가하는 방법을. 이 기술은 바이러스 벡터 없이 안전하고 비용 효율적인 CAR T 세포 치료를 가능하게 합니다.

암 면역 요법을 위해 mRNA를 사용하여 일시적인 키메라 항원 수용체 T 세포를 생성하는 비바이러스 접근법

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