Name: Identification of Functionally-Relevant Lentivirus Integration Sites in an Insertional mutagenesis cell library(삽입 돌연변이 유발 세포 라이브러리에서 기능적으로 관련된 렌티바이러스 통합 부위 식별) (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-01-10T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 28 s
Description: 배우세요 렌티바이러스 삽입 돌연변이를 활용한 기능적 게놈 요소 식별 방법인 InSET 기법입니다. 이 프로토콜은 인간 게놈의 미탐색 영역에서 새로운 기능적 엑손을 발견하여 질병 연구와 생물학 이해에 기여합니다.

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D.X.는 중국 국립 자연 과학 재단(32000441), 중국 푸젠성 자연 과학 재단(2023J01130), 화차오 대학교 중앙 대학 기초 연구 기금(ZQN-924) 및 화차오 대학교 과학 연구 기금(18BS205)의 지원을 받습니다. PK는 중국 국립 자연 과학 재단(32170619), 국립 자연 연구소의 국제 고위 과학자를 위한 연구 기금의 지원을 받습니다. 중국과학재단(32150710525), 중국 푸젠성 자연과학재단(2020J02006).

그림 1은 InSET 메소드의 개략도를 제공합니다. 최적의 커버리지를 위해 1μg의 게놈 DNA에서 5개의 병렬 라이브러리를 준비한 다음 차세대 염기서열분석을 위해 풀링합니다. 이 절차는 이전 테스트에서 지속적으로 성공적으로 완료되었지만 사용자는 재량에 따라 일시 중지 지점을 도입할 수 있습니다. 이 연구에 사용된 시약 및 장비에 대한 자세한 정보는 Table of Materials에서 확인할 수 있습니다.
1. 게놈에서 렌티바이러스 통합 부위 캡처
<ol>
	<li>이전 연구에서 설명한 바와 같이 렌티바이러스 기반 삽입 돌연변이 유발 세포 라이브러리(1μg)32에서 설명한 바와 같이 렌티바이러스 기반 삽입 돌연변이 유발 세포 라이브러리(1μg)를 PCR 튜브에서 1x Taq Buffer, 2.5 U Taq DNA 중합효소, 4μL의 dNTP 혼합물(각 2.5mM) 및 0.3μM의 비오틴화된 프라이머 3-LTR_prime(표 1)을 포함하는 50μL 반응에서 선형 PCR의 템플릿으로 사용합니다. 
참고: 3-LTR_prime 프라이머는 렌티바이러스 염기서열의 LTR 영역에 어닐링됩니다. 5' LTR로 어닐링하는 경우, 증폭된 단편에는 측면 게놈 염기서열이 포함됩니다. 3' LTR로 어닐링하면 증폭된 단편에는 내부 렌티바이러스 염기서열이 포함되어 있으며, 이는 숙주 게놈에 정렬할 수 없으므로 다운스트림 염기서열분석 데이터 분석 중에 필터링됩니다. 이 primer는 insertional mutagenesis cell library를 생성하는 데 사용되는 다른 유형의 벡터에 적응하도록 수정할 수도 있습니다.</li>
	<li>표준 PCR thermocycler에서 선형 PCR의 50 사이클을 수행하고, 시작 시 2.5 U의 Taq DNA 중합효소를 추가하고 25 사이클 직후에 다시 추가합니다. PCR 조건은 다음과 같습니다 : 94 ° C 5 분; 30초 동안 94°C, 30초 동안 55°C, 30초 동안 72°C의 50 사이클; 72 °C 5 분 동안 
	참고: 장시간 반응 동안 Taq DNA 중합효소의 활성을 유지하려면 반응의 시작과 중간 지점 모두에 효소를 추가하는 것이 좋습니다.</li>
	<li>PCR 산물을 새롭고 깨끗한 1.5mL 원심분리 튜브로 옮깁니다.</li>
	<li>PCR 산물을 10μL의 비오틴-스트렙타비딘 마그네틱 비드와 철저히 혼합합니다.</li>
	<li>혼합물을 실온에서 2시간 동안 배양하고 금속 수조에서 400rpm으로 흔듭니다. 
	알림: 15분마다 튜브를 꺼내 피펫과 잘 섞입니다.</li>
	<li>마그네틱 스탠드를 사용하여 비드를 모은 다음 상층액을 조심스럽게 제거합니다.</li>
	<li>비드를 300μL의 Binding/Wash Buffer(10mM의 Tris-HCl(pH 7.5), 1mM의 EDTA, 1M의 NaCl, 0.1% Tween-20)로 6회 세척하고 상등액을 버립니다.</li>
	<li>300 μL (65 °C) DNase/RNase-free 증류수로 2회 세척하고 상층액을 버립니다.</li>
	<li>두 번째 가닥 합성의 경우, PCR 튜브에 1x Klenow Fragment Buffer, 2μL의 dNTP 혼합물(각 2.5mM) 및 6.25μM의 P5_N6 프라이머(표 1)를 포함하는 24μL 반응 부피에서 비드를 재현탁 
	참고: 프라이머의 100μM 원액P5_N6 준비합니다. P5_N6 프라이머는 5' 말단에 고정된 P5 어댑터 서열과 3' 말단에 무작위 헥사머 서열로 구성됩니다. 무작위 헥사머는 다양한 범위의 표적 염기서열에 결합할 수 있어 선형 PCR을 통해 생성된 다양한 DNA 단편을 증폭하는 데 적합합니다.</li>
	<li>PCR 열순환기에서 15°C에서 20분 동안 혼합물을 사전 배양합니다.</li>
	<li>2 U의 Klenow Fragment (Large Fragment E.coli DNA Polymerase)를 추가합니다.</li>
	<li>뒤에 오는 조건에 PCR thermocycler에 있는 혼합물을 배양하십시오: 15 °C에서 25 °C에 0.5 °C/min에 천천히 경사하게 후에 30 분 배양; 그 후에 37 °C에 0.5 °C/min에 천천히 경사로 다음 1개의 h 외피.</li>
	<li>PCR 산물을 새롭고 깨끗한 1.5mL 원심분리 튜브로 옮깁니다.</li>
	<li>마그네틱 스탠드를 사용하여 비드를 캡처한 다음 상층액을 버립니다.</li>
	<li>300 μL의 4 °C DNase/RNase-free 증류수로 비드를 부드럽게 세척합니다. 비드를 모으고 상층액을 버립니다.</li>
</ol>
2. 중첩된 PCR을 이용한 NGS 라이브러리 구축
<ol>
	<li>PCR 튜브에서 1x Taq Buffer, 1.25 U Taq DNA Polymerase, 0.5 μM의 primer P5(표 1), 2 μL의 dNTP 혼합물(각 2.5 mM) 및 0.5 μM의 primer 3-LTR_Nest(표 1)을 포함하는 25 μL PCR 반응 부피에서 1.15단계의 비드를 재현탁합니다.</li>
	<li>뒤에 오는 조건 하에서 PCR thermocycler에 있는 PCR 반응을 실행하십시오: 3 분 동안 94 °C; 30 s 동안 94 °C, 30 s 동안 55 °C 및 30 s 동안 72 °C의 20 주기; 7 분 동안 72 °C.</li>
	<li>1x Taq 완충액, 2.5 U Taq DNA 중합효소, 4 μL의 dNTP 혼합물 (각각 2.5 mM), 0.4 μM의 프라이머 Illumina_P5(표 1) 및 0.4 μM의 프라이머 Illumina_P7-3LTR (표 1)을 포함하는 50 μL 볼륨에서 PCR의 다음 라운드를 위한 템플릿으로 2.2 단계의 PCR 생성물 5 μL를 사용합니다(표 1).</li>
	<li>뒤에 오는 조건 하에서 PCR thermocycler에 있는 PCR 반응을 실행하십시오: 3 분을 위한 94 °C; 30 s 동안 94 °C, 30 s 동안 55 °C, 및 30 s 동안 72 °C의 15 주기; 7 분 동안 72 °C.</li>
	<li>PCR 산물을 깨끗한 1.5mL 원심분리 튜브로 옮깁니다. 
	참고: 이 단계에서 프로토콜을 일시 중지할 수 있으며 samples는 -20 °C에서 저장할 수 있습니다.</li>
	<li>1.2x 부피의 DNA 클린 비드를 사용하여 PCR 산물을 정제하여 최종 부피를 21 μL. 로 만듭니다.
	참고: 병렬로 준비된 5개의 라이브러리 각각에서 10μL의 PCR 산물을 취하여 함께 풀링하고 최종 부피 21μL로 정제합니다. PCR 산물에 대한 정제 프로토콜은 DNA 클린 비드에 대한 제조업체의 지침에 따라 조정됩니다(재료 표 참조).
	<ol>
		<li>비드를 2-8 °C에서 실온까지 30 분 동안 평형을 이룹니다.</li>
		<li>반전 또는 볼텍싱으로 구슬을 철저히 혼합합니다.</li>
		<li>깨끗한 1.5mL 원심분리 튜브에 비드의 1.2배 부피를 피펫팅합니다.</li>
		<li>PCR 산물을 비드에 넣고 위아래로 10회 피펫팅하여 철저히 혼합합니다.</li>
		<li>DNA가 비드에 결합할 수 있도록 실온에서 5분 동안 배양합니다.</li>
		<li>샘플을 마그네틱 스탠드에 놓고 용액이 투명해지면 상층액을 제거합니다(약 5분).</li>
		<li>200μL의 80% 에탄올을 첨가하여 비드를 세척하고 실온에서 30초 동안 배양한 다음 상층액을 제거합니다. 
		참고: 80% 에탄올은 신선하게 준비해야 합니다.</li>
		<li>2.6.7단계를 한 번 반복합니다.</li>
		<li>뚜껑을 열고 약 5분 동안 실온에서 비드를 자연 건조합니다.</li>
		<li>마그네틱 스탠드에서 튜브를 제거하고 DNase/RNase가 없는 증류수 22μL를 넣고 위아래로 10회 피펫팅하여 철저히 혼합한 다음 실온에서 2분 동안 그대로 둡니다.</li>
		<li>용액이 투명해질 때까지(약 2분) 튜브를 마그네틱 스탠드에 놓은 다음 21μL의 상등액을 깨끗한 1.5mL 원심분리 튜브로 옮깁니다. 
		참고: 이 단계에서 프로토콜을 일시 중지할 수 있으며 samples는 -20 °C에서 저장할 수 있습니다.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>1 μL의 정제된 PCR 산물을 사용하여 시판되는 dsDNA 형광 검출 키트(재료 표 참조)와 함께 형광계를 사용하여 농도를 측정합니다. 
	알림: 농도 측정 프로토콜은 dsDNA 검출 키트에 대한 제조업체의 지침을 따릅니다.
	<ol>
		<li>시약과 완충액(키트에 제공됨)을 1:200의 비율로 혼합하여 작업 용액 준비를 준비합니다.</li>
		<li>10 μL의 표준 #1과 10 μL의 표준 #2(키트에 제공됨)를 각각 190 μL의 작업 용액과 혼합하여 분석 표준물질을 준비합니다. 혼합물을 2-3초 동안 부드럽게 와류로 가열합니다.</li>
		<li>정제된 PCR 산물 1μL와 작업 용액 190μL를 혼합하여 분석 샘플을 준비합니다. 혼합물을 2-3초 동안 부드럽게 와류로 가열합니다.</li>
		<li>분석 표준물질과 분석 샘플을 실온에서 2분 동안 배양하여 빛으로부터 보호합니다.</li>
		<li>형광측정기를 켭니다.</li>
		<li>메인 메뉴에서 dsDNA 고감도 프로그램을 선택합니다.</li>
		<li>교정을 위해 표준 #1을 기계에 삽입하고 Read standard 버튼을 눌러 첫 번째 표준을 측정한 다음 Standard #2를 삽입하고 Read standard 버튼을 눌러 두 번째 표준을 측정합니다.</li>
		<li>샘플 측정의 경우 Run samples 버튼을 눌러 샘플 측정 페이지로 이동합니다. 분석 샘플이 들어 있는 각 튜브를 삽입하고 Read tube 버튼을 눌러 농도를 얻습니다. 
		참고: 이 단계에서 프로토콜을 일시 중지할 수 있으며 samples는 -20 °C에서 저장할 수 있습니다.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>30기가베이스(GB) 규모에서 쌍단 150bp(PE150) 전략을 사용하여 Illumina 플랫폼에서 NGS를 수행합니다. 
	참고: 이 단계는 일반적으로 염기서열분석 회사에 아웃소싱됩니다.</li>
</ol>
3. 데이터 분석
참고: 이 섹션에서는 인간 세포주 분석이 예로 사용되었습니다.
<ol>
	<li>렌티바이러스 통합 부위 매핑
	<ol>
		<li>fastp tool33을 사용하여 50% 이상의 저품질 염기(Phred score <20), 15개 이상의 'N' 염기 또는 150개 미만의 염기가 있는 염기서열분석 판독을 필터링합니다(재료 표 참조).</li>
		<li>LTR 태그 "GCCTTGTGTGTGGTAGATCCACAG 로 시작하는 읽기 2가 있는 페어링된 엔드 읽기만 선택합니다.
		ATCAAGGATATCTTGTCTTCGTTGGGAGTGAAT 
		TAGCCCTTCCA". 
		참고: 이 염기서열은 insertional mutagenesis cell library를 생성하는 데 사용되는 벡터의 염기서열에 따라 다릅니다.</li>
		<li>3.1.2단계에서 선택한 읽기에서 LTR 태그 시퀀스를 자릅니다.</li>
		<li>기본 설정으로 BWA-MEM 34(재료 표 참조)를 사용하여 트리밍된 읽기를 GRCh37/hg34에 정렬합니다.</li>
		<li>read 1과 read 2가 모두 FLAG 147 및 FLAG 163으로 표시된 올바른 구성과 간격으로 게놈에 고유하게 매핑되는 read 쌍만 유지합니다.</li>
		<li>삽입 위치를 trimmed read 2의 첫 번째 정렬된 베이스로 정의합니다.</li>
		<li>각 고유 삽입 부위의 판독 횟수를 각 샘플에서 고유하게 정렬된 총 판독 수로 정규화합니다.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>세포 적합성에 영향을 미치는 삽입물 식별(IACF) 
	참고: 통계 분석에서는 대조 샘플과 처리된 샘플의 세 가지 생물학적 복제물을 쌍으로 비교하여 크게 농축되거나 고갈된 위치를 식별하는 것이 좋습니다. 위에서 언급한 반복 횟수는 최소입니다. 결과의 신뢰성과 정확성을 보장하기 위해 실질적으로 가능한 한 많은 반복실험을 사용하는 것이 좋습니다.
	<ol>
		<li>각 위치의 정규화된 읽기 횟수를 변환하여10개의 값을 기록합니다.</li>
		<li>읽기가 0인 위치의 로그10개 값을 -5로 설정합니다.</li>
		<li>로그10 값에 대해 양측 쌍을 이룬 스튜던트 t-검정을 수행합니다.</li>
		<li>R 환경 내에서 Benjamini-Hochberg 방법을 사용하여 다중 비교를 위해 p-값을 조정합니다.</li>
		<li>FDR(False Discovery Rate) 임계값이 25%인 위치를 IACF로 선택합니다.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>세포 적합성에 영향을 미치는 클러스터 식별(CACF) 
	참고: 이 분석을 위해 대조군 및 처리된 샘플의 세 가지 생물학적 복제가 권장되었습니다.
	<ol>
		<li>FDR 임계값이 1%인 SICER35(재료 표 참조)를 사용하여 대조 샘플과 처리된 샘플 사이에 크게 농축되거나 고갈된 삽입 클러스터를 식별합니다. SICER 분석을 위한 명령은 "sh $SICER/SICER.sh $InputDir $In $Control $OutputDir hg19 1 10 1 0.8 30 0.01"입니다. 
		참고: 위 명령에서 매개변수의 의미는 다음과 같습니다: ["InputDir"] ["처리된 샘플 삽입 부위 베드 파일"] ["제어 샘플 삽입 부위 베드 파일"] ["OutputDir"] ["종"] ["이중화 임계값"] ["창 크기(bp)"] ["단편 크기"] ["유효 게놈 분획"] ["갭 크기(bp)"] ["E-값"].</li>
		<li>BEDTools suite36(재료 표 참조)의 "intersect" 기능을 사용하여 두 개 이상의 생물학적 복제가 공유하는 클러스터 영역을 얻고 이러한 클러스터 영역을 CACF로 표시합니다.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

InSET: A Novel Tool for Unbiased Genome-Wide Functional Element Discovery

<ol><li>Kapranov, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+transcriptional+activity+in+chromosomes+21+and+22%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Large-scale transcriptional activity in chromosomes 21 and 22.</a> Science. 296 (5569), 916-919 (2002).</li>
<li>Bertone, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+identification+of+human+transcribed+sequences+with+genome+tiling+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Global identification of human transcribed sequences with genome tiling arrays.</a> Science. 306 (5705), 2242-2246 (2004).</li>
<li>Carninci, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transcriptional+landscape+of+the+mammalian+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The transcriptional landscape of the mammalian genome.</a> Science. 309 (5740), 1559-1563 (2005).</li>
<li>Kapranov, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+majority+of+total+nuclear-encoded+non-ribosomal+RNA+in+a+human+cell+is+%27dark+matter%27+un-annotated+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biol%22%5BJournal%5D)">The majority of total nuclear-encoded non-ribosomal RNA in a human cell is 'dark matter' un-annotated RNA.</a> BMC Biol. 8, 149(2010).</li>
<li>Djebali, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Landscape+of+transcription+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Landscape of transcription in human cells.</a> Nature. 489 (7414), 101-108 (2012).</li>
<li>Kapranov, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Examples+of+the+complex+architecture+of+the+human+transcriptome+revealed+by+race+and+high-density+tiling+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Examples of the complex architecture of the human transcriptome revealed by race and high-density tiling arrays.</a> Genome Res. 15 (7), 987-997 (2005).</li>
<li>Denoeud, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prominent+use+of+distal+5%27+transcription+start+sites+and+discovery+of+a+large+number+of+additional+exons+in+encode+regions%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Prominent use of distal 5' transcription start sites and discovery of a large number of additional exons in encode regions.</a> Genome Res. 17 (6), 746-759 (2007).</li>
<li>Mercer, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+RNA+sequencing+reveals+the+deep+complexity+of+the+human+transcriptome%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Targeted RNA sequencing reveals the deep complexity of the human transcriptome.</a> Nat Biotechnol. 30 (1), 99-104 (2011).</li>
<li>Deveson, I. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Universal+alternative+splicing+of+non-coding+exons%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Syst%22%5BJournal%5D)">Universal alternative splicing of non-coding exons.</a> Cell Syst. 6 (2), 245-255.e5 (2018).</li>
<li>Xu, D., Tang, L., Kapranov, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complexities+of+mammalian+transcriptome+revealed+by+targeted+RNA+enrichment+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Genet%22%5BJournal%5D)">Complexities of mammalian transcriptome revealed by targeted RNA enrichment techniques.</a> Trends Genet. 39 (4), 320-333 (2023).</li>
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저자는 공개하지 않았습니다.

순방향 유전학 분석에서 게놈 워킹은 삽입 돌연변이 유발 세포 라이브러리의 통합 부위를 프로파일링하는 데 필수적입니다. I-PCR 및 LAM-PCR과 같은 고전적인 게놈 워킹 방법은 종종 제한 효소 소화 및 결찰이 필요하며, 이는 라이브러리 복잡성을 줄이고 효소 부위 의존성으로 인한 편향을 유발할 수 있습니다 27,28,29. InSET 방법은 제한 분해 및 결찰 단계를 제거하여 이러한 한계를 극복합니다. 이는 측면 서열 지수 고정 PCR(FLEA-PCR)37과 유사하지만 레트로바이러스 내부 서열의 증폭을 피하기 위해 블로킹 올리고뉴클레오티드의 사용을 생략함으로써 더욱 단순화됩니다. 대신 이러한 서열은 NGS 데이터 분석 중에 제거됩니다. NGS 응용 분야를 위해 설계된 InSET은 삽입 돌연변이 유발 세포 라이브러리에서 ...

기능적 유전체학은 포스트 게놈 시대에도 여전히 중요하고 도전적인 분야로 남아 있으며, 게놈 영역의 상당 부분은 여전히 기능적 특성화가 부족합니다. 이러한 문제의 주요 원인은 단백질 코딩 및 비코딩 영역 모두에서 광범위한 전사 및 보편적인 대체 스플라이싱을 특징으로 하는 인간 게놈 및 전사체의 복잡한 특성에 있습니다1,2,3,4,5. 이러한 복잡성은 RNA 표적 농축 연구를 통해 광범위하게 강조되었습니다6,7,8,9. 인간 게놈의 잘 주석이 달린 세그먼트 외에도 수많은 새로운 게놈 요소가 매핑되지 않고 기능적으로 주석이 없는 상태로 남아 있다는 사실이 점점 더 인식되고 있습니다10,11,12.
최근 몇 년 동안 RNA 간섭(RNAi) 및 CRISPR/Cas 시스템과 같은 역유전학 도구의 발전이 관찰되었습니다13,14,15,16,17,18,19,20,21. 그러나 이러한 방법은 짧은 헤어핀 RNA(shRNA) 또는 단일 가이드 RNA(sgRNA)의 복잡한 라이브러리 생성과 관련된 비특이적 효과 및 높은 비용을 포함하여 주목할만한 단점이 있습니다22,23,24,25. 또한 이러한 방법은 주로 주석이 달린 게놈 요소에 중점을 둡니다. 대조적으로, 순방향 유전학은 주석이 없는 새로운 기능적 게놈 요소를 식별할 수 있는 이점이 있습니다. 인간 게놈 및 전사체의 복잡성과 수많은 새로운 게놈 요소를 감안할 때 이러한 순방향 유전학 능력은 매우 중요합니다.
순방향 유전학 세포 라이브러리는 무작위 레트로바이러스 통합을 통해 생성되는 경우가 많기 때문에 순방향 유전학 분석에 있어 게놈 전체 통합 부위의 효율적인 검출이 중요합니다. 이러한 통합 사이트를 탐지하려면 일반적으로 게놈 보행 도구26이 포함됩니다. 이러한 도구에서 상당한 발전이 있었지만 차세대 염기서열분석(NGS) 응용 분야에 최적화되어 삽입성 돌연변이 유발 연구에 적용된 도구는 거의 없습니다. 세포주에서의 삽입 돌연변이 유발은 종종 Inverse PCR(I-PCR) 또는 선형 증폭 매개 PCR(LAM-PCR)과 같은 방법을 사용하여 통합 부위를 검출합니다27,28,29. 그러나 이러한 방법은 일반적으로 제한 효소 분해 또는 결찰 단계가 필요하며, 이는 효율성을 감소시키고 결과에 편향을 유발할 수 있습니다.
순 유전학 스크리닝에서 게놈 전체 통합 부위의 효율적인 검출을 향상시키기 위해 InSET(Insertion-based Screen for functional Elements and Transcripts) 방법이라는 방법이 여기에 도입되었습니다. InSET은 게놈 워킹(genome-walking)과 NGS를 통합함으로써 렌티바이러스 기반 삽입 돌연변이 유발 라이브러리에서 렌티바이러스 통합 부위를 고처리량으로 식별할 수 있습니다. 기존 방법27,28,29에 비해 InSET은 상대적으로 간단하고 간단하여 제한 효소 분해 또는 결찰 단계를 제거하여 더 편리하고 접근하기 쉽습니다. 더욱이, 포유류 세포의 기존 순유전학 스크리닝은 극소수의 반수체 또는 준반수체 세포주에 국한되어 있지만27,28,29,30,31, InSET은 이수성 세포주에서 작동하는 것으로 입증되었습니다32.
이 연구는 InSET 메소드를 구현하기 위한 자세한 단계별 프로토콜을 제공합니다. 또한 삽입 돌연변이 유발 연구에서 InSET의 적용을 보여줍니다. InSET은 인간 세포주에서 단백질 코딩 및 비코딩 RNA를 모두 포함하는 게놈 요소 내에서 새로운 엑손을 식별하기 위한 강력한 도구 역할을 합니다.

<table><tbody><tr><td>0.5 M EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>AM9260G</td><td>바인딩 / 세척 버퍼</td></tr><tr><td>1 M Tris-HCl (Ph 8.0)</td> <td>Invitrogen</td><td>15568025</td><td>바인딩 / 세척 버퍼</td></tr><tr><td>10 회를 만들기 위해; Klenow 프래그먼트 버퍼&nbsp;</td><td>Takara</td><td>2140A</td><td></td></tr><tr><td>10회; Taq 버퍼</td><td>Tiangen</td><td>ET101-01-01</td><td></td></tr><tr><td>5 M NaCl</td><td>Invitrogen</td><td>AM9659</td><td>바인딩 / 세척 버퍼</td></tr><tr><td>BeaverBeads Streptavidin</td><td>Beaver</td><td>22307-1</td><td>1 &mu; m</td></tr><tr><td>BEDTools</td><td></td><td>소프트웨어, v2</td><td>https://bedtools.readthedocs.io/en/latest/</td></tr> <tr><td>BWA-MEM</td><td></td><td></td><td>소프트웨어, v0.7.12</td></tr><tr><td>dNTP 혼합물</td><td>Takara</td><td>4030</td><td>2.5 mM 각</td></tr><tr><td>Equalbit dsDNA HS 분석 키트</td><td>Vazyme</td><td>EQ111-02</td><td></td></tr><tr><td>fastp</td><td></td><td></td><td>소프트웨어</td></tr><tr><td>HiSeq X Ten</td><td>Illumina</td><td>SY-412-1001</td><td>Illumina 플랫폼, Novogene Corporation (Beijing)에 아웃소싱</td></tr><tr><td>Klenow Fragment</td><td>Takara</td><td>2140A</td><td></td></tr><tr><td>NovaSeq 6000</td><td>Illumina</td><td>20012850</td><td>Illumina 플랫폼, Novogene Corporation (Beijing)에 아웃소싱Qubit</td></tr> <tr><td>3.0 Fluorometer</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Q33216</td><td></td></tr><tr><td>SICER</td><td></td><td></td><td>Software, v1.1</td></tr><tr><td>Taq DNA 중합효소</td><td>Tiangen</td><td>ET101-01-01</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>HuShi</td><td>30189328</td><td>바인딩/세척 버퍼</td></tr><tr><td>UltraPure 증류수</td><td>Invitrogen</td><td>10977015</td><td></td></tr><tr><td>VAHTS DNA 클린 비드</td><td>Vazyme</td><td>N411-01</td><td></td></tr></tbody></table>

identification of functionally-relevant lentivirus integration sites in an insertional mutagenesis cell library(삽입 돌연변이 유발 세포 라이브러리에서 기능적으로 관련된 렌티바이러스 통합 부위 식별)

Identification of Functionally-Relevant Lentivirus Integration Sites in an Insertional Mutagenesis Cell Library

인간 게놈 내 기능적 염기서열의 범위는 생물학에서 중추적이지만 논쟁의 여지가 있는 주제입니다. 고처리량 역 유전자 스크리닝이 이를 탐구하는 데 큰 진전을 이루었지만 종종 범위를 알려진 게놈 요소로 제한하고 비특이적 효과를 유발할 수 있습니다. 이는 게놈 기능에 대한 보다 심층적이고 편견 없는 이해를 가능하게 하는 새로운 기능적 유전체학 도구의 시급한 필요성을 강조합니다. 이 프로토콜은 렌티바이러스 기반 삽입 돌연변이 유발 세포 라이브러리 내에서 렌티바이러스 통합 부위를 식별하는 방법인 InSET(Insertion-based Screen for functional Elements and Transcripts)를 소개합니다. InSET은 측면 염기서열을 검출하고 정량화하는 데 사용되는 차세대 염기서열분석을 통해 게놈 전반의 렌티바이러스 통합 부위를 쉽게 캡처할 수 있습니다. InSET의 설계는 표현형 스크리닝의 통합 부위 풍부도 변화를 대규모로 분석할 수 있게 하여 순방향 유전학 및 기능적 유전체 요소를 식별하기 위한 강력한 도구로 자리매김할 수 있습니다. InSET의 주요 이점은 이전 주석과 무관하게 단백질 코딩 및 비코딩 RNA의 새로운 기능적 엑손을 포함하여 이전에 확인되지 않은 게놈 요소를 밝힐 수 있다는 것입니다. 전반적으로 InSET은 많은 게놈 요소가 기능적 특성화를 기다리고 있는 인간 게놈 및 전사체의 복잡한 복잡성을 연구하는 데 상당한 가치를 가지고 있습니다.

일반적으로 시퀀싱 제공업체에서 수행하는 NGS 라이브러리의 품질 관리 평가는 시퀀싱 전의 표준 품질 검사 단계입니다. 라이브러리 품질의 영향을 입증하기 위해 두 가지 샘플을 비교하였습니다. s2-20-15로 표시된 고품질 라이브러리는 20 사이클의 1차 증폭과 15 사이클의 2차 증폭으로 구성된 표준 네스티드 PCR(nested PCR) 프로토콜을 사용하여 준비되었습니다. 이와 대조적으로, s1-30으로 표시된 저품질 라이브러리는 Illumina 어댑터를 결합하기 위해 30 사이클의 단일 단계 PCR을 사용하여 준비되었습니다.
표 2에 나타낸 바와 같이, 저품질 샘플은 형광 측정과 qPCR 측정 모두에서 고품질 샘플보다 라이브러리 농도가 낮게 나타났습니다. 특히, qPCR 농도 측정은 형광 측정보다 NGS 라이브러리 품질을 더 신뢰할 수 있게 나타내는 지표입니다. 라이브러리를 bioanalyzer를 사용하여 추가로 분석하였습니다. 저품질 샘플의 경우...

삽입 돌연변이 유발은 기능적 게놈 요소를 식별하기 위한 순 유전학의 필수 도구입니다. 여기에서는 렌티바이러스 기반 삽입 돌연변이 유발 세포 라이브러리 내에서 렌티바이러스 통합 부위를 검출하는 방법인 InSET(Insertion-based Screen for functional Elements and Transcripts)에 대해 설명합니다.

Identification of Functionally-Relevant Lentivirus Integration Sites in an Insertional mutagenesis cell library(삽입 돌연변이 유발 세포 라이브러리에서 기능적으로 관련된 렌티바이러스 통합 부위 식별)

The extent of functional sequences within the human genome is a pivotal yet debated topic in biology. Although high-throughput reverse genetic screens ...

identification-functionally-relevant-lentivirus-integration-sites-an

Research

연구

JoVE Journal

Genetics

유전학

감염된 세포의 게놈 DNA에서 레트로바이러스 통합 부위를 증폭하고, 증폭된 바이러스-숙주 접합부를 염기서열분석한 다음, 이러한 염기서열을 참조 게놈에 매핑하는 프로토콜을 설명합니다. 또한 BEDTools를 사용하여 다양한 게놈 주석과 관련된 통합 부위의 분포를 정량화하는 기술에 대해서도 설명합니다.

레트로 바이러스 통합 사이트의 증폭, 차세대 시퀀싱 및 게놈 DNA 매핑

이 원고는 상향 및 하향 벡터 - 숙주 접합 DNA를 동시에 분석 할 수있는 양방향 통합 사이트 분석을위한 실험 절차 및 소프트웨어 분석을 설명합니다. 양방향 PCR 제품은 모든 다운 스트림 시퀀싱 플랫폼에 사용할 수 있습니다. 결과 데이터는 통합 DNA 표적의 높은 처리량, 정량적 비교에 유용합니다.

양방향 레트로 바이러스 통합 사이트 PCR 방법론 및 정량적 데이터 분석 워크 플로

여기, 우리는 인간 세포에서 Moloney 뮤린 백혈병 바이러스 기반의 레트로 바이러스 벡터의 통합 사이트의 게놈 전체 매핑을위한 프로토콜을 설명합니다.

레트로 바이러스 스캐닝 : MLV 통합 사이트 맵핑으로 세포 특정 규제 지역 정의

우리는 셀에 CRISPR/Cas9를 제공 하기 위한 차량으로 integrase 불충분 한 lentiviral 벡터 (IDLVs)의 생산 전략을 설명 합니다. 셀에서 편집 하는 신속 하 고 강력한 유전자를 중재 하는 능력, IDLVs 안전 제시와 유전자 배달에 대 한 동등 하 게 효과적인 벡터 플랫폼 integrase 유능한 벡터에 비해.

CRISPR/Cas9-중재 유전자 녹아웃 셀 분할에 대 한 Integrase 불충분 한 Lentiviral 벡터의 생산을 위한 프로토콜

우리는 선택 된 게놈 사이트에 proviral 통합 정리 에이즈-1 감염에 대 한 새로운 체 외 모델의 생성에 대 한 게놈 엔지니어링 워크플로우를 제시. 에이즈-파생 된 기자 들의 CRISPR Cas9 중재, 사이트별 게놈 조작에 의해 촉진 된다. 단일 셀 클론 세대, 심사, 그리고 올바른 대상 확인에 대 한 자세한 프로토콜 제공 됩니다.

CRISPR-Cas9-기반 게놈 엔지니어링 선택한 Proviral 통합 사이트와 에이즈-1 감염에 대 한 Jurkat 기자 모델을 생성 하

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대상<em&gt; 현장에서</em신진 효모에서&gt; 돌연변이 유발 히스톤의 유전자

간단 하 고 효율적인 비용 효율적인 대규모 gRNA 라이브러리를 생성 하기 위한 방법 이어야 한다. 우리는 표적 DNA의 효소 소화에 따라 gRNA 라이브러리의 생산에 대 한 프로토콜을 설명 합니다. 이 메서드를 CORALINA (제어 nuclease 활동을 통해 포괄적인 gRNA 라이브러리 세대) 비용이 많이 드는 사용자 지정 oligonucleotide 종합에 대안을 선물 한다.

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클러스터는 정기적으로 짧은 구조 반복/CRISPR 관련 된 단백질 9 (CRISPR/Cas9) interspaced 시스템 유전 공학에 대 한 유망한 도구를 제공 하 고 transgenes 대상된 통합의 가능성을 엽니다. (HMEJ)에 가입 하는 homology 중재 끝 설명-효율적인 DNA 비보에 통합 대상 및 CRISPR/Cas9를 사용 하 여 유전자 치료를 대상으로 전략을 기반으로.

CRISPR/Cas9-중재 대상된 통합에서 Vivo에서 Homology 중재 끝에 합류 기반 전략을 사용 하 여

이 문서에는 분열 효 모에 대상 유전자의 무작위 mutagenesis에 대 한 자세한 방법을 설명합니다. 예를 들어, 우리가 대상 rpt4 +, 19S 프로테아좀 섬으로 불안정 돌연변이 대 한 스크린의 소 단위를 인코딩하는.

분열 효 모 섬으로 불안정 프로테아좀 돌연변이 선택할 임의의 Mutagenesis 유전자 타겟팅

배우세요 렌티바이러스 삽입 돌연변이를 활용한 기능적 게놈 요소 식별 방법인 InSET 기법입니다. 이 프로토콜은 인간 게놈의 미탐색 영역에서 새로운 기능적 엑손을 발견하여 질병 연구와 생물학 이해에 기여합니다.

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