Name: 기도에서 곰팡이 포자의 공간 역학을 보존하는 쥐 폐를 이미징하는 효율적인 방법 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-12-13T14:40:00.000+00:00
Duration: 10 min 6 s
Description: 학습하세요 쥐 폐에서 공기 주입 및 혈관 관류를 이용하여 곰팡이 포자의 자연 위치를 보존하는 효율적인 방법을. 형광 현미경으로 기도 내용물을 정밀 분석하여 폐 감염에서 상피 세포와 포자 상호작용을 연구합니다.

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이 프로토콜에 설명된 모든 방법은 Rutgers Biomedical Health Sciences의 IACUC(Institutional Animal Care and Use Committee)의 승인을 받았습니다.
1. 세포 내 형광으로 포자 표시
<ol>
	<li>카르복시플루오레세인 숙시니미딜 에스테르(CFSE), 세포 추적기 오렌지 또는 세포 추적기 빨간색(또는 선택한 세포 내 염료)에 1 x 106 포자를 30°C에서 30분 동안 5μM로 염색한 다음 PBS로 세척하고 12,000 x g에서 포자를 회전시킵니다 . 이 세척을 한 번 반복합니다.</li>
	<li>25μL에 마우스 한 마리에 대한 적절한 포자 용량이 포함되도록 적절한 농도에서 포자 접종을 준비합니다.</li>
</ol>
2. 이소플루란 마취를 이용한 흡인 흡입을 통한 포자 마우스 접종
주의: 이소플루란은 휘발성 마취제이며 덕트가 있는 생물 안전 캐비닛 또는 흄 후드 내에서 사용해야 합니다.
<ol>
	<li>이소플루란 노출 용기를 준비하려면 접힌 냅킨을 1L 나사 상단 Nalgene 용기에 넣고 냅킨 위에 플라스틱 메쉬 원을 마우스용 플랫폼으로 놓습니다. 냅킨에 이소플루란 2mL를 넣고 용기를 닫은 다음 용기에서 가스가 평형을 이룰 때까지 1-2분 동안 기다립니다.</li>
</ol>
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67556/67556fig01.jpg"> 
그림 1: 포자 접종의 이소플루란 개방 드롭 방법을 위한 장치. 접힌 냅킨을 1L 나사 상단 항아리의 바닥에 놓은 다음 원형 플라스틱 메쉬를 삽입하여 마우스의 플랫폼 역할을합니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67556/67556fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<ol start="2">
	<li>마우스를 마취에 노출시키기 전에 25μL의 접종물이 포함된 피펫을 준비합니다. 마우스를 이소플루란 용기에 넣고 용기를 기울여 마우스가 의식을 잃고 거꾸로 된 오른쪽 반사 상실을 모니터링합니다. 일반적으로 약 10초가 걸립니다.</li>
	<li>안정시 RR의 약 50%인 분당 50-80회(bpm)로 일관되게 느려질 때까지 호흡수(RR)를 모니터링합니다. 이것은 일반적으로 10초가 더 걸립니다. 이때, 이소플루란 용기에서 마우스를 꺼냅니다. 참고: 이것은 고농도의 이소플루란으로, 빠른 마취 유도를 일으키며 마우스는 매우 면밀히 모니터링해야 합니다. 치명적인 이소플루란 과다 투여는 이소플루란의 농도가 가변적일 수 있고 이소플루란에 대한 용량-반응 곡선이 매우 가파르기 때문에 위험합니다. 호흡 속도가 50bpm 미만으로 떨어지거나 불규칙한 경우 마우스를 이소플루란에서 제거하고 3-5분 동안 회복할 때까지 기다린 다음 다시 시도합니다(최대 2회 반복 시도).</li>
	<li>발가락 꼬집음에 대한 반응 부족으로 마취 깊이를 확인합니다. 그런 다음 한 손으로 마우스를 누운 자세로 놓고 마우스가 증가하는 속도(50-60bpm에서 시작)와 활력으로 3-5번의 규칙적인 헐떡임 호흡을 할 수 있도록 합니다. 이것이 시작되면, 피펫 끝을 쥐 구인두의 뒤쪽에 놓고 흡입하는 동안 접종물을 방출합니다. 참고: 입을 통한 이러한 헐떡임은 호흡을 위한 부속 근육의 동원으로 인해 머리를 열등하게 충격을 줍니다. 이러한 헐떡임 중에 피펫을 삽입하면 헐떡일 때마다 입이 열려야 합니다. 입이 열리지 않으면 마우스가 충분히 마취되지 않은 상태이며 구인두의 내용물을 흡입하지 못할 가능성이 높습니다. 피펫은 혀를 눌러 입의 아래쪽과 앞쪽으로 밀어 접종물을 삼키지 않도록 해야 합니다. 피펫이 입에 들어가고 마우스가 적절하게 마취되면 마우스는 헐떡일 때마다 입을 벌립니다.</li>
	<li>손과 엄지손가락으로 마우스를 잡고 마우스 흉부의 뒤쪽과 앞쪽에서 딱딱거리는 소리를 느껴 접종물의 흡입을 확인합니다.</li>
</ol>
3. 쥐의 안락사
<ol>
	<li>희생 시점 10분 전에 200mg/kg 케타민과 24mg/kg 자일라진의 칵테일을 마우스에 복강내 주사합니다.</li>
	<li>주사 후 마우스가 수술 마취 평면에 들어갈 때까지 10분 동안 기다리며, 발가락 꼬집음에 대한 반응 부족으로 확인됩니다.</li>
</ol>
4. PBS와 포르말린을 가진 폐의 관류
<ol>
	<li>마취된 마우스에 70% 에탄올을 분사합니다. 가위를 사용하여 마우스의 피부를 잘라내고 피부를 당겨 모든 면의 복막을 노출시킵니다. 마우스의 위쪽 절반에서 피부를 머리 위로 당기고 피부에서 팔을 빼냅니다.</li>
	<li>흉골과 흉곽의 아래쪽을 따라 복막을 잘라 복막을 노출시킵니다. 간을 하위로 치환하여 횡격막을 드러냅니다. 폐 자체에 구멍이 뚫리지 않도록 가위를 사용하여 횡격막을 폐 실질에서 조심스럽게 뚫습니다. 참고: 실수로 폐에 구멍을 뚫으면 후속 공기 팽창이 불가능해집니다.</li>
	<li>횡격막에 구멍이 뚫린 후 공기가 흉부로 들어가 폐를 무너뜨립니다. 왼쪽의 흉곽을 잘라 심장을 드러냅니다. 30G 바늘로 5-10mL의 PBS를 5초당 1mL의 속도로 우심실에 주입하여(혈관 손상을 방지하기 위해) 폐를 빠르게 희게 합니다. 주의: 포르말린은 덕트가 있는 생물 안전 캐비닛 또는 흄 후드 내에서 취급해야 하는 유해 휘발성 물질입니다.</li>
	<li>완료되면 바늘을 제거하고 새 바늘을 사용하여 5mL의 10% 중성 완충 포르말린(NBF)을 동일한 비율로 우심실에 주입합니다.</li>
</ol>
5. 관류된 폐를 공기 팽창시키기
<ol>
	<li>흉곽의 앞쪽 절반을 제거합니다. 기관을 노출시키려면 목의 오른쪽과 왼쪽에 있는 위쪽 갈비뼈와 쇄골을 자릅니다. 기관이 놓일 정중선 근처에서 절단하지 않도록 주의하십시오. 집게로 목 정중선에 남아 있는 위쪽 갈비뼈와 쇄골을 잡고 기관이 노출될 때까지 위쪽으로 당깁니다.</li>
	<li>10cm 길이의 봉합사를 준비하여 기관 아래로 당기고 노출된 기관의 아래쪽 끝에 느슨한 매듭을 미리 묶습니다. 18G 카테터로 1mL 공기 주사기를 준비합니다. 18G 바늘을 사용하여 노출된 부위의 위쪽 끝에 있는 기관에 구멍을 뚫습니다.</li>
	<li>카테터를 그 구멍에 삽입하여 공기가 빠져나가는 것을 방지하기 위해 비교적 단단히 끼워지도록 합니다. 10초 동안 1mL의 공기를 폐에 천천히 주입하면서 모든 엽의 폐 팽창을 관찰합니다. 완전히 팽창하면 폐가 심장을 약간 감싸고 구멍이 뚫리지 않은 횡격막에서 차지하는 부피를 채웁니다.</li>
	<li>기관 주위의 매듭을 단단히 당기고 카테터를 제거합니다. 기관을 잡고 뭉툭한 가위를 사용하여 쥐에서 폐를 제거하고 폐에 구멍을 뚫지 않도록 주의하십시오.</li>
</ol>
6. 침수 기질 및 탈수
<ol>
	<li>50mL의 10% NBF 20ml로 채워진 10mL 원추형 튜브의 상단 가장자리에 폐를 놓습니다. 봉합사 나사산을 원뿔형 바깥쪽에 두고, 캡을 조이고, 원뿔형을 뒤집어 폐가 20mL의 NBF에 거꾸로 매달려 있도록 합니다. 4 ° C에서 24-48 시간 동안 두십시오.</li>
	<li>PBS로 폐를 헹군 다음 30% 수크로오스-PBS(w/v) 용액에 4°C에서 72-96시간 동안 넣어 폐를 탈수시켜 동결 보존을 준비합니다. 자당에서 폐를 제거하고 폐를 최적 절단 온도(OCT) 매체의 극저온 몰드에 넣고 표본을 -80°C에서 동결합니다.</li>
</ol>
7. 냉동 절편
<ol>
	<li>절편 전 1시간 동안 OCT cryoblocks의 시료를 저온 유지 장치의 -20°C 온도로 평형을 이룹니다. 20-100 μm 두께로 블록을 절단합니다. 알림: 공기 팽창은 시편의 취약성을 증가시킬 수 있으며 증가된 두께로 절단하면 절편 중 조직 파손을 방지할 수 있습니다.</li>
	<li>유리 슬라이드에 절편을 모으고 조직이 슬라이드에 부착되도록 30분에서 1시간 동안 건조시킵니다. 참고: 이 단계에서 슬라이드는 -80°C에서 유지될 수 있습니다.</li>
</ol>
8. 슬라이드 준비 및 차단
<ol>
	<li>슬라이드를 PBS 수조(접시 또는 Coplin 용기에 담기)에 실온(RT)에서 30분 동안 놓아 슬라이드에서 OCT를 제거합니다. 참고: 두꺼운 부분(40-100μm)은 유리 슬라이드와 얇은 부분에 달라붙지 않을 수 있으므로 Coplin 항아리에 옆으로 눕히는 것보다 접시에 평평하고 똑바로 세우는 것이 가장 좋습니다.</li>
	<li>OCT가 조직에서 용해된 후 슬라이드를 건조시킵니다. 물티슈를 사용하여 조직 표본 주변의 슬라이드 주변에서 과도한 물방울을 건조시킵니다. </li>
	<li>소수성 Pap 펜을 사용하여 표본 주위에 둘레를 그리고 5분 동안 건조시킵니다.</li>
	<li>슬라이드당 300mL에 0.3% Tween-20 및 1:100 Fc 블록으로 동물이 없는 차단 용액의 차단 완충액을 준비합니다. 참고: 세포 내 타겟의 경우 1% Tween-20을 사용할 수 있습니다. 일반적으로 300μL의 부피로 충분하지만, 조직을 완전히 덮는 데 필요한 부피는 소수성 마커의 둘레 크기에 따라 다릅니다. 이 시점부터 조직이 건조되어서는 안 됩니다.</li>
	<li>RT에서 1시간 동안 슬라이드의 차단 용액을 그대로 둡니다.</li>
</ol>
9. 면역염색
<ol>
	<li>유체를 피펫으로 분리하고 300-500 μL의 PBS를 첨가하여 슬라이드를 세척합니다. 세탁을 한 번 반복합니다.</li>
	<li>0.33% Tween-20(또는 세포 내 표적의 경우 1%)을 함유한 비동물 차단 용액에 1차 AlexaFluor-647 접합 쥐 항-마우스 EpCAM(클론 G8.8) 항체(기도 상피 마커)를 준비합니다. 이 용액의 슬라이드당 300μL를 추가하고 4°C에서 밤새 염색합니다. 참고: 항체는 염색 농도, 시간 및 온도에 대해 경험적으로 테스트해야 합니다. 얇은 부분(8-20 μm)은 37 °C에서 30분 동안, 더 두꺼운 부분(20-100 μm)은 대부분의 항체에 대해 1:100 희석액을 사용하여 4°C에서 하룻밤 동안 염색합니다. 비접합 항체를 사용하는 경우 2x(위와 같이)를 세척하고 경험적으로 결정된 시간과 온도에 대해 2차 형광 항체를 적용합니다. 일반적으로 2차 항체 염색은 1:1000 희석에서 1시간 동안 RT에서 수행됩니다.</li>
	<li>검체에서 항체 용액을 제거하고 PBS 300mL로 슬라이드를 5분 동안 세척합니다. 이 세척을 한 번 반복하십시오. 슬라이드를 건조시켜 표본과 주변 유리에서 과도한 액체를 모두 제거합니다.</li>
	<li>각 조직 조각에 RT 소프트 세트 마운팅 미디어(예: SlowFade Glass) 한 방울을 추가합니다. 거품이 생기지 않도록 병을 거꾸로 놓고 한 방울 한 방울을 티슈에 천천히 떨어뜨립니다. 적절한 크기의 커버 슬립을 샘플과 소수성 마커 둘레를 넘어 확장할 수 있도록 배치합니다.</li>
</ol>
10. 형광성 현미경 검사법을 통한 화상 진찰
<ol>
	<li>멀티채널 형광 현미경을 사용하여 개별 포자 및 숙주 세포를 분해하기에 충분한 해상도의 대물렌즈를 사용하여 편향되지 않은 방식으로 전체 폐 절편을 스캔합니다(예: NA = 0.8 또는 이와 유사한 20x 오일 대물렌즈를 사용하는 Zeiss Axioscan 7). 알림: 레이저 출력 및 PMT 전압 이득은 FMO(Fluorescence Minus One) 제어로 결정된 배경에서 대상의 신호 대 잡음비를 최대화하도록 설정됩니다.</li>
	<li>전체 폐엽을 캡처할 수 있는 충분한 이미지 타일을 수집합니다(예: 400μm x 400μm 크기의 ~200개 타일). 현미경 소프트웨어 프로그램(예: Zeiss ZEN 3.7 또는 이와 유사한 것)을 사용하여 다운스트림 처리를 위해 병합된 타일 이미지를 내보냅니다.</li>
</ol>
11. QuPath를 통한 공간 분석
<ol>
	<li>무료 오픈 소스 소프트웨어인 QuPath(14)에서 프로젝트 파일을 만들고 파일에 형광 이미지를 추가합니다.</li>
	<li>상단 메뉴 옵션인 Classify(분류)를 클릭한 다음 Pixel classification(픽셀 분류) &gt; Create Thresholder(임계값 생성)를 클릭하여 EpCAM+ 픽셀을 상피로 분류합니다. 해상도, 채널, 평활화 시그마 및 대상 영역을 가장 잘 식별하는 임계값을 선택합니다. 분류자를 고유한 이름으로 저장하고 개체 만들기를 선택합니다.</li>
	<li>새 Create objects(개체 만들기 ) 창에서 New object type(새 개체 유형 )을 Annotation(주석)으로 선택합니다. 폐 상피의 경우 최소 개체 크기와 최소 구멍 크기를 100mm2로 설정합니다. 여기서 개체 분할 을 선택할 필요가 없습니다. 확인을 선택하면 주석이 생성되고 왼쪽 상단 영역에 있는 브러시 도구를 사용하여 눈으로 수정할 수 있습니다.</li>
	<li>포자를 분류하려면 포자가 캡처된 채널을 사용하여 11.3-11.4의 단계를 반복하고 새 개체 유형을 주석이 아닌 감지로 만듭니다. 최소 객체 크기와 최소 구멍 크기를 0mm2로 설정하고 객체 분할을 선택합니다.</li>
	<li>포자의 공간 분석을 수행하려면 상단 메뉴 옵션인 Analyze &gt; Spatial Analysis &gt; Calculate signed distance to annotations 2D를 선택합니다. 감지된 각 포자에 대해 EpCAM+ 상피까지의 거리가 계산됩니다. 상단 메뉴 옵션인 Measure &gt; Export Measurements를 통해 내보냅니다.</li>
</ol>

<meta charset="utf8"></head><body>형광 현미경 분석을 위한 폐의 곰팡이 포자 국소화 보존

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<li>Bodnar, M. J., Ratuski, A. S., Weary, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+isoflurane+anesthesia+using+the+drop+method%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Anim%22%5BJournal%5D)">Mouse isoflurane anesthesia using the drop method.</a> Lab Anim. 57 (6), 623-630 (2023).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>18 G, 1 1/2 바늘 (305185)</td><td>피셔</td><td>305185</td><td></td></tr><tr><td>1 L&nbsp; 스크류탑 항아리&nbsp; (날진)</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-823-33</td><td></td></tr><tr><td>Air-Tite 벌크 비멸균 주사기 10 mL 루어 락</td><td>Fisher</td><td>14-817-175</td><td></td></tr><tr><td>AnaSed 주사(자일라진 멸균 용액)</td><td>Akorn</td><td>59399-110-20</td><td></td></tr><tr><td>동물 무함유 차단제 및 희석제, R.T.U.</td><td>Vector</td><td>SP-5035-100</td><td></td></tr><tr><td>BD Insyte Autoguard 날개 달린 차폐 IV 카테터, BD Vialon 카테터 재료 18 G x 1.88 in</td><td>BD</td><td>381547</td><td></td></tr><tr><td>Pharmingen 정제 쥐 안티 마우스 CD16 / CD32 (마우스 BD Fc 블록 및 거래;)</td><td>BD</td><td>553142</td><td></td></tr><tr><td>CellTracker 오렌지 CMRA 염료</td><td>피셔 과학</td><td>NC0873640</td><td></td></tr><tr><td>CFSE</td><td>Labviva</td><td>75003</td><td></td></tr><tr><td>콕시디오이데스 포사다시 cts2/ard1/cts3&델타; &nbsp;</td><td>BEI Resources</td><td>NR-166</td><td></td></tr><tr><td>Corning 70 미크론 스트레이너</td><td>VWR</td><td>10054-456</td><td></td></tr><tr><td>EpCAM AlexaFluor647 단클론 항체</td><td>Biolegend</td><td>118211</td><td></td></tr><tr><td>Exel International HYpodermic 바늘 30 G x 1/2"</td><td>Labviva</td><td>EN3012</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand 일회용 멸균 주사기 (1mL, Leur Slip)</td><td>Fisher</td><td>14-955-462</td><td></td></tr><tr><td>포도당 일수화물</td><td>Azer Scientific&nbsp;</td><td>ES17530-500G</td><td></td></tr><tr><td>고진공 그리스</td><td>VWR</td><td>59344-055</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342 솔루션 20 mM (5 mL)</td><td>ThermoFischer</td><td>62249</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane USP</td><td>Covetrus</td><td>29405</td><td></td></tr><tr><td>케타민 염산염</td><td>Dechra</td><td>1000001250</td><td></td></tr><tr><td>KIMWIPES 섬세한 작업 와이퍼 (4.4'' x 8.4")</td><td>VWR</td><td>21905-026</td><td></td></tr><tr><td>Lexer Baby Scissors</td><td>FST</td><td>14078-10</td><td></td></tr><tr><td>Micro-Adson Forceps</td><td>FST</td><td>11018-12</td><td></td></tr><tr><td>Neutral Buffered Formalin (10%) (Azer Scientific)</td><td>Fisher</td><td>22-026-350</td><td></td></tr><tr><td>Nunc EasYFlask 조직 배양 플라스크, T75, 필터 캡</td><td>VWR</td><td>15708-134</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>VWR</td><td>45000-446</td><td></td></tr><tr><td>Peel-A-Way 임베딩 몰드</td><td>Sigma</td><td>E6032-1CS</td><td></td></tr><tr><td>QuPath 0.5.1 소프트웨어</td><td>오픈 소스</td><td>https://qupath.github.io/</td><td></td></tr> <tr><td>실크 봉합사 실 크기 3/0</td><td>FST</td><td>18020-30</td><td></td></tr><tr><td>슬라이드마이크로 슬라이드 Superfrost Plus&nbsp;</td><td>VWR</td><td>48311-703</td><td></td></tr><tr><td>SlowFade Glass Soft-set Antifade Mountant (2 mL)</td><td>ThermoFischer</td><td>S36917</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma</td><td>S0389-500G</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek O.C.T. Compound, Sakura Finetek</td><td>VWR</td><td>25608-930</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>ThermoFischer</td><td>J20605. AP</td><td></td></tr><tr><td>Vector Laboratories ImmEDGE 소수성 배리어 펜 2개 세트</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9545623</td><td></td></tr><tr><td>VWR 마이크로 커버 안경, 직사각형 (24 mm x 40 mm #1.5)</td><td>VWR</td><td>48393-230</td><td></td></tr><tr><td>흰색 플라스틱 와이어 메시</td><td>MAPORCH</td><td>789862904922</td><td></td></tr><tr><td>효모 추출물</td><td>Fisher</td><td>BP9727-500</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss AxioScan 7&nbsp;</td><td>Carl Zeiss Microscopy GmbH</td><td>https://www.zeiss.com/microscopy/us/products/imaging-systems/axioscan-for-biology.html</td><td>다채널 형광 현미경</td></tr><tr><td>ZEN 3.7 소프트웨어</td><td>Carl Zeiss Microscopy GmbH</td><td>https://www.zeiss.com/microscopy/us/products/software/zeiss-zen.html</td><td>현미경 소프트웨어</td></tr></tbody></table>

기도에서 곰팡이 포자의 공간 역학을 보존하는 쥐 폐를 이미징하는 효율적인 방법

Efficient Method for Imaging Murine Lungs that Preserves Spatial Dynamics of Fungal Spores in the Airways

이 방법은 궁극적으로 생리학적 공기 팽창을 사용하여 기도가 방해받지 않도록 마우스 폐의 면역 형광 이미지를 생성합니다. 중요한 것은 그 과정에서 여러 체크포인트를 통해 프로토콜의 구성 요소가 성공적으로 수행되었는지 확인할 수 있다는 것입니다. 접종하는 동안 액체가 기도로 들어갔다는 것을 나타내는 마우스의 뒤쪽 흉벽에서 "딱딱거리는 소리"를 느껴 접종이 흡인되었는지 확인하는 것이 중요합니다. 딱딱거리는 소리가 나지 않으면 쥐가 접종물을 삼켰을 가능성이 있습니다. 생쥐 폐에 PBS를 관류하면 폐가 하얗게 변한 후 폐 전체가 완전히 하얗게 됩니다(그림 2A). 불완전한 미백이 있는 경우, 후속 포르말린 관류가 폐 실질의 모든 영역에 도달하지 않습니다(그림 2B). 폐를 공기로 팽창시킬 때 폐는 생리학적 크기에 도달할 때까지 천천히 팽창해야 합니다. 폐 내부의 공기를 확보하기 위해 기관 봉합사를 묶은 후에는 폐의 크기가 수축하지 않아야 합니다. 만약 그렇다면, 시술 중에 폐에 구멍이 났을 가능성이 있습니다.
여기에서는 공기 팽창 및 포르말린 액체 팽창 폐 모두에서 Coccidioides posadasii cts2/ard1/cts3Δ 포자(녹색) 및 EpCAM+ 원주 세기관지 상피(자홍색)가 표시된 단면의 대표 이미지를 보여줍니다(각각 그림 3A, B ). 이 포자는 주로 원위 세기관지와 원위 세기관지에 바로 인접한 폐포 공간에 축적되며, 아마도 치조관에 축적됩니다. 공기로 팽창된 고정제가 관류된 폐에는 포자가 세기관지 상피에서 약간 더 분산되어 보이는 액체 고정액(그림 3B)보다는 세기관지 내에서 더 자주 나타나고 세기관지에 더 가깝게 군집하는 포자(그림 3A)가 포함되어 있습니다. QuPath 공간 분석을 통해 개별 포자가 가장 가까운 EpCAM+ 세기관지 상피까지의 거리를 측정하여 포자가 세기관지에서 더 멀리 떨어진 더 원위적인 폐포 공간으로의 분산 수준을 나타냅니다. 우리는 액체 팽창이 생리학적 공기 팽창에 비해 포자를 세기관지에서 더 멀리 분산시킨다는 것을 보여줍니다(그림 4A, B). 공기 팽창 혈관 관류는 원위 세기관지에서 이러한 포자의 자연스러운 위치를 보존하고 기관 내 고정 점안에 의해 이러한 포자가 더 원위 폐포 공간으로 인위적으로 분산되는 것을 방지합니다.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67556/67556fig02.jpg"> 
그림 2: 폐 관류 성공 표시. (A) 성공적으로 관류된 폐는 완전히 흰색이 됩니다. (B) 불완전하게 관류된 폐는 분홍색 또는 얼룩덜룩한 모양으로 나타납니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67556/67556fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67556/67556fig03.jpg"> 
그림 3: 공기가 팽창된 포르말린이 주입된 폐와 포르말린이 팽창된 폐의 포자 분포를 보여주는 대표적인 이미지. 세포 내 형광 포자(녹색)는 (B) 포르말린이 팽창된 폐보다 (A) 공기로 팽창된 폐에서 EpCAM+ 세기관지 상피(자홍색)에 더 가깝게 분포하는 것으로 보입니다. 이미지는 20배 배율로 다중 채널 형광 현미경에서 각 치료 그룹의 마우스의 왼쪽 엽 후방면에서 1.2mm 깊이의 절편에서 얻었으며 현미경 소프트웨어를 사용하여 타일을 스티칭했습니다. 스케일 바 = 800μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67556/67556fig03large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67556/67556fig04.jpg"> 
그림 4: 공기로 팽창된 폐와 포르말린으로 팽창된 포자로 처리된 폐 사이의 포자에서 세기관지 상피까지의 거리(mm) 비교. 치료 그룹당 3마리의 마우스에서 폐를 1 x 106 Coccidioides posadasii cts2/ard1/cts3Δ arthroconidia를 접종한 후 1.5시간 동안 수확, 가공 및 이미지화했습니다. 좌엽의 뒤쪽 표면에서 0.8mm, 1.2mm, 1.6mm 및 2.0mm에서 마우스당 4개의 절편을 샘플링하고 염색하고 다중 채널 형광 현미경에서 이미지화했습니다. 각 그룹의 모든 포자는 QuPath에서 검출되고 공간적으로 분석되어 (A) 가장 가까운 EpCAM+ 원주 세기관지 상피까지의 거리와 (B) 중앙값 및 95% 신뢰 구간이 마이크로미터 단위로 표시됩니다. 공기 팽창 포자, n = 11,673. 액체 인플레이션 포자, n = 9,837. Mann-Whitney t-검정은 정규성 부족으로 인해 수행되었으며 p &lt; 0.0001입니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67556/67556fig04large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

Fungi infect humans when environmental spores are inhaled into the lungs. The lung is a heterogeneous organ. Conducting airways, including bronchi and ...

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Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

우리는 그들이 병원균을 phagocytose 또는 호중구 세포 트랩 (그물) 생성하는 동안 감염된 폐의 호중구 granulocytes의 역학의 관​​찰에 대한 2 광자 현미경을 사용하는 방법, 표시합니다.

2 광자 현미경을 사용하여 감염된 폐의 Neutrophils에 의해 Phagocytosis와 NET - 형성의 직접 관측

이 비디오는 인플레이션을 위해 아가로스를 사용하여 암세포와 기질 세포 간의 상호 작용을 연구하기 위해 생체 외 라이브 이미징을 위해 폐를 준비하는 방법을 설명합니다. 샘플 프로토콜에서는 살아있는 세포 상호작용을 관찰하기 전에 아가로스 팽창 절차가 설명됩니다.

Whole Lung Agarose Inflation: 생체 외 라이브 이미징을 위해 폐를 준비하는 방법

우리는 쥐에 형광 기자를 활용, 폐 전이에서 종양 세포 기질 상호 작용의 생체 라이브 영상에 대한 비교적 간단한 방법을 설명합니다. 스피닝 디스크 공 촛점 현미경을 사용하여,이 기술은 최소 4 시간 동안 생균의 시각화를 가능하게하고 다른 염증성 폐 상태를 학습하도록 구성 될 수있다.

예는 폐 전이 및 그들의 미세 환경의 라이브 영상을 생체 내

이 프로토콜은 다광자 현미경을 사용하여 진공 안정화 이미징 창을 사용하여 실시간으로 온전한 폐의 장기 고해상도 단일 세포 이미징을 수행하는 방법을 설명합니다.

진공 안정 이미징 창으로 폐의 장기 고해상도 생체 내에 현미경

우리 비-침략 적 multimodal 접근 bleomycin의 이중 intratracheal 주입에 의해 유도 된 마우스 폐 섬유 증 모델의 경도 평가 대 한 마이크로-CT와 형광 분자 단층에 따라 이미지를 설명 합니다.

Multimodal 접근을 이미징 Bleomycin 유도 폐 섬유 증 생쥐에서의 경도 평가 대 한 마이크로-CT와 형광 분자 단층에 따라

결핵균 (M. 결핵) 기자 효소 형광 (REF)를 사용 하 여 감염 된 쥐의 광학 이미징을 설명 합니다. 이 프로토콜 pathogenesis, 치료 및 백신 연구에 대 한 전 임상 동물 모델에 M. 결핵 의 과민 하 고 특정 탐지를 촉진 한다.

기자 효소 형광와 쥐에서 이미징 결핵균

여기는 Gomori의 수정된 methanamine 실버 조직학 단면도에서 얼룩의 정량화 하 여 침략 aspergillosis와 쥐에 폐 선 부담을 결정 하는 프로토콜에 설명 합니다. 이 방법의 사용 결과 폐 균 DNA의 양이 많은 PCR에 의해 곰 팡이 부담에 대 한 평가에 비해 적은 동물과 비교 결과.

조직학 정량화 폐 실험 Aspergillosis에 곰 팡이 부담을 결정 하

이 연구에서는 선물이 인플루엔자 바이러스 감염 후 murine tracheal 점 막에서 2 광자 intravital 이미징 및 세포 상호 작용 분석을 수행 하는 프로토콜. 이 프로토콜은 호흡기 감염 시 면역 세포 역학을 공부 하는 연구자와 관련이 있을 것입니다.

영상 셀 상호 작용 Tracheal 점 막에서 2 광자 Intravital 현미경 검사 법을 사용 하 여 인플루엔자 바이러스 감염 중

이 간행물에서는, 우리는 이중 양식 방사성 핵종 화상 진찰을 이용하는 생체내 마우스에 있는 기도 점원 클리어런스 (MCC)를 평가하기 위한 프로토콜을 기술합니다. 이 프로토콜은 이중 SPECT/CT 시스템에서 마우스 전신(MWB) 콜리메이터를 사용하여 단일 광자 방출 컴퓨팅 단층 촬영(SPECT) 및 컴퓨터 단층 촬영(CT) 획득 프로토콜을 위해 설계되었습니다.

마우스의 점도 클리어런스의 생체 내 평가

우리는 마우스의 기도에서 아스퍼질러스 퓨미가투스 코니디아 (크기 3 μm)의 분포의 정량적 분석을위한 방법을 설명합니다. 또한 이 방법은 다양한 병리학적 상태 모델에서 기도내의 미세입자 및 나노입자 응집 분포의 분석에 사용될 수 있다.

전체 마운트 광학 클리어 마우스 폐에서 아스퍼 질러스 fumigatus Conidia 분포의 공초점 레이저 스캐닝 현미경 검사 현미경 기반 정량 분석

여기서는 BSL-2 승인 마이코박테리움 결핵 증의 감쇠 체내 영상 프로토콜을 제시합니다. 영구 폐 창을 이용한 쥐 폐 내 스트레스. 이 접근법은 동일한 폐 미세환경 내에서 세균 위치, 혈관 역학, 대식세포 흡수 등 초기 숙주-병원체 상호작용의 종단적 단일 세포 분해 분석을 가능하게 합니다.

초기 혈관 내 감염 중 쥐 폐에서 희석된 위영양성 결핵 균의 생명체 내 영상

학습하세요 쥐 폐에서 공기 주입 및 혈관 관류를 이용하여 곰팡이 포자의 자연 위치를 보존하는 효율적인 방법을. 형광 현미경으로 기도 내용물을 정밀 분석하여 폐 감염에서 상피 세포와 포자 상호작용을 연구합니다.

기도에서 곰팡이 포자의 공간 역학을 보존하는 쥐 폐를 이미징하는 효율적인 방법

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