Isolation And Dendritic Cell-Uptake of Small Extracellular Vesicles from Echinococcus granulosus(Echinococcus granulosus에서 작은 세포외 소포의 분리 및 수지상 세포 흡수)

우리의 연구는 Echinococcus granulosus 세포외 소포의 특성화와 기생충-숙주 상호 작용에서의 역할에 중점을 둡니다. 우리는 숙주 수지상 세포에 의한 조성 흡수와 면역 조절에 대한 잠재적 영향을 조사합니다. 우리는 E. granulosus EV가 수지상 세포에 의해 흡수되어 성숙 및 항원 제시에 영향을 미친다는 것을 입증했습니다. 우리는 또한 기생충-숙주 상호 작용 및 면역 반응에 영향을 미칠 수 있는 EV 화물에서 주요 면역 조절 및 항원 단백질을 식별합니다.

당사의 프로토콜은 향상된 소형 EV 생산을 위해 시험관 내 기생충 배양을 최적화하고 고품질 분리를 보장하며 면역 조절을 연구하기 위해 수지상 세포 분석을 통합합니다. 전체 또는 부분적으로 적용할 수 있습니다. 우리의 향후 연구는 면역 반응에 대한 E. granulosus EV의 생체 내 효과, 백신 성분으로서의 잠재력, 수지상 세포, 마이크로파지 및 이러한 세포의 면역 모델에 미치는 영향을 탐구할 것입니다.

[해설자] 시작하려면 포충병이 있는 안락사된 마우스의 복부 표면을 70% 알코올을 사용하여 청소합니다. 가위와 겸자를 사용하여 발달된 metacestodes를 제거하기 위해 복막강을 외과적으로 엽니다. 그런 다음 겸자를 사용하여 metacestode 덩어리를 멸균 페트리 접시로 옮깁니다. 필요한 경우 겸자를 사용하여 결합 조직을 제거하여 metacestode 덩어리에서 낭종을 해제합니다. 얻은 metacestodes를 보충된 PBS로 섭씨 4도에서 세척합니다. 이제 필요한 모든 구성 요소를 사용하여 배양 배지를 준비하고 용액을 반전시켜 부드럽게 혼합합니다. 준비된 배양 배지 5밀리리터를 각 Leighton 튜브에 옮깁니다. 기생충을 배양 배지에 추가하고 배지를 교체하지 않고 섭씨 37도에서 5일 동안 튜브를 배양합니다. 각 Leighton 튜브에서 기생충 배양 배지를 수집하여 15밀리리터 원추형 튜브로 옮깁니다. 수집된 배지를 섭씨 4도에서 10분 동안 300g에서 원심분리하고 상청액을 새로운 15밀리리터 원뿔형 튜브로 옮깁니다. 이제 상청액을 섭씨 4도에서 10분 동안 2,000g으로 원심분리합니다. 생성된 상청액을 피펫을 사용하여 새 1.5밀리리터 튜브로 옮깁니다. 튜브를 섭씨 4도에서 30분 동안 10,000g으로 원심분리하여 더 작은 세포 파편을 제거합니다. 피펫을 사용하여 상층액을 초원심분리기 로터에 적합한 튜브로 옮깁니다. 튜브의 한쪽 면을 마커로 표시합니다. 그리고 표시된 면이 위를 향하도록 튜브를 로터에 놓습니다. 튜브를 섭씨 4도에서 1시간 동안 100,000g으로 원심분리합니다. 상청액을 빠르게 붓고 튜브를 1분 동안 거꾸로 놓습니다. 오염된 단백질을 제거하기 위해 최소 3밀리리터의 PBS로 펠릿을 세척합니다. 모든 튜브 면을 따라 피펫을 사용하여 펠릿을 여러 번 재현탁하고 펠릿이 있을 것으로 예상되는 표시된 면에 초점을 맞춥니다. 초원심분리를 반복한 후, 펠릿을 30마이크로리터의 PBS에 재현탁합니다. 재현탁된 샘플을 1.5밀리리터 튜브로 옮기고 세포외 소포를 섭씨 영하 80도에서 동결하여 보관합니다. 안락사된 5주에서 8주 된 암컷 CF-1 마우스를 조직 배양 후드에 넣기 전에 에탄올을 뿌립니다. 누운 자세로 해부판에 마우스를 놓습니다. 겸자와 해부 가위를 사용하여 요도 위에 수직 T 절개를 하고 하지 상단까지 수평으로 확장합니다. 집게를 사용하여 양쪽 뒷다리를 따라 피부를 분리하여 다리 뼈와 조직을 노출시킵니다. 손으로 발목에서 복부 쪽으로 밀고 피부를 반대쪽으로 당겨 양쪽 다리에 피부가 없는 상태로 한 후 각 다리의 피부를 제거합니다. 이제 가위와 겸자를 사용하여 대퇴골과 경골을 조심스럽게 제거하여 파손되지 않도록 합니다. 집게로 각 뼈의 끝을 고정합니다. 그리고 힘줄을 잘라 뼈 주변의 근막을 제거합니다. 종이 냅킨으로 근육 조직을 완전히 청소합니다. 제거된 각 뼈를 2밀리리터의 보충된 완전 RPMI 배지가 들어 있는 멸균 50밀리리터 튜브에 넣어 파편을 제거합니다. 배지를 버린 후 뼈를 70% 에탄올로 매번 5분 동안 두 번 씻습니다. 세척된 뼈를 멸균 페트리 접시로 옮기고 날카로운 해부 가위를 사용하여 두 개의 뼈 골단을 잘라 골수 세포에 접근합니다. 완전 배지가 들어 있는 20밀리리터 주사기에 부착된 25게이지 바늘을 사용하여 4개의 뼈 각각에서 골수 세포를 멸균 페트리 접시에 조심스럽게 씻어냅니다. 그런 다음 피페팅하여 골 결합 조직과 세포 덩어리를 제거하여 피배된 골수를 포함하는 배지를 부드럽게 균질화합니다. 샘플을 멸균 50밀리리터 원추형 튜브로 옮기고 멸균 70마이크로미터 폴리프로필렌 세포 여과기를 통해 세포를 통과시켜 결합 조직과 뼈 파편을 제거합니다. 세포를 섭씨 4도에서 7분 동안 450g에서 원심분리합니다. 상청액을 조심스럽게 제거하고 폐기하여 펠릿이 튜브 벽에 계속 부착되도록 합니다. 세포를 실온에서 1분 동안 배양한 후, 500마이크로리터의 RBC 용해 완충액에 재현탁하고 용해 완충액을 3밀리리터의 완전 배지로 중화합니다. 세포를 섭씨 4도에서 7분 동안 450g에서 원심분리합니다. 상청액을 버리고 펠릿을 5밀리리터의 완전 배지에 재현탁합니다. 시연된 대로 샘플을 필터링한 후 혈구계를 사용하여 세포를 계산합니다. 재조합 쥐 FMS 관련 티로신 키나아제 3 리간드 또는 FLT3L의 밀리리터당 300나노그램을 배양 배지에 첨가합니다. 밀리리터당 6개 세포의 거듭제곱으로 10의 1곱 농도로 멀티웰 플레이트에 세포를 도금합니다. 이산화탄소 5%가 포함된 가습 분위기에서 섭씨 37도에서 7일 동안 세포를 배양합니다. 3일째에 세포를 방해하지 않고 각 웰에서 배지 1밀리리터를 제거하고 재조합 쥐 FLT3L 밀리리터당 150나노그램을 보충한 예열된 신선한 완전 배지 1밀리리터로 교체합니다. Echinococcus granulosus 유충 단계에서 정제된 세포외 소포 또는 EV는 주로 동적 광 산란 및 투과 전자 현미경으로 확인된 50에서 200나노미터 범위의 크기를 가진 작은 EV였습니다. 골수 유래 수지상 세포는 7일 동안 형태학적 분화를 보여 작고 둥근 조혈 세포에서 세포질 확장이 있는 성상 모양의 세포로 진행되었습니다. 배양 1시간 후, 수지상 세포는 공초점 현미경으로 확인된 바와 같이 엔도솜-리소좀 구획에서 MHCIII 분자와 공동 국소화된 형광 표지된 작은 EV를 포획했습니다.