탈세포화된 마우스 폐와 1차 인간 내피 세포를 이용한 생체공학적 폐 이식

생명공학 인간 크기의 장기는 많은 양의 자원이 필요하며 이는 종종 학술 실험실의 용량을 초과합니다. 반복적인 프로토콜 개발 비용을 줄이면 이 분야의 연구 진전이 가속화될 것입니다. 본 연구의 목적은 마우스 심폐 차단을 이용한 폐 생명공학을 위한 표준화된 프로토콜을 제공하는 것이다. 어떤 세포가 장기 생명공학에 적합한지, 그리고 이러한 세포를 장기 생물반응기 배양에 어떻게 통합해야 하는지는 아직 알려지지 않았습니다. 확장 가능하고 재현 가능한 프로토콜을 확립하기 위해 여러 유형의 세포와 조건을 비교해야 합니다.

쥐는 작고 다루기 쉬운 실험 동물입니다. 그러나 크기는 작지만 폐의 기본 구조는 포유류마다 유사합니다. 이 작은 플랫폼에서 프로토콜을 최적화함으로써 동물의 크기에 따라 최적화된 결과를 곱하기만 하면 레이저 동물 모델을 확장할 수 있습니다. 이 마우스 크기의 폐 생명공학 플랫폼을 통해 연구자들은 줄기 세포를 효율적으로 테스트할 수 있습니다. 이러한 유전자 변형 세포는 전체 폐 공학에 사용하기에는 귀중하거나 비용이 많이 들 수 있습니다. 또한 환자 유래 세포를 사용하여 시험관 내에서 질병 모델을 만들 수도 있습니다.

현재의 노력에는 폐 생명공학에 필요한 증식 잠재력과 차등 능력을 파악하기 위해 여러 유형의 조작된 줄기 세포와 전구 세포를 테스트하는 것이 포함됩니다. 적합한 세포가 확인되면 이 연구는 돼지와 같은 더 큰 동물 모델로 확장될 것입니다.

[해설자] 시작하려면 안락사된 마우스를 수술대 위에 누운 자세로 놓고 팔다리를 고정합니다. 70% 에탄올을 가슴과 복부에 골고루 뿌려 살균합니다. 다음으로 스테인리스 가위를 사용하여 목까지 뻗어 있는 정중선을 따라 복강을 열고 흉골을 쪼개줍니다. 흉벽에서 횡격막을 절제합니다. 복부 흉벽을 절단하여 흉강을 노출시키고 흉선을 제거합니다. 4/0 실크 봉합사를 사용하여 하대정맥과 오른쪽 상대정맥을 위대하게 만듭니다. 배액을 위해 스테인리스 가위로 복부 대동맥을 자릅니다. 27게이지 바늘이 장착된 5밀리리터 멸균 주사기를 사용하여 심실벽에 구멍을 뚫어 우심실에 멸균 PBS 3밀리리터를 주입합니다. Dumont 겸자를 사용하여 주요 폐동맥 주위에 4/0 실크 봉합사를 감습니다. 그런 다음 스프링 가위를 사용하여 폐동맥 판막 아래에 2mm 창을 잘라 우심실 벽에 접근합니다. 창을 통해 폐동맥 카테터를 삽입하고 미리 고리가 있는 4/0 실크 봉합사로 고정합니다. 5밀리리터 주사기를 사용하여 폐동맥 카테터를 통해 2밀리리터의 PBS를 천천히 주입합니다. 기관 카테터로 기관을 캐뉼라하고 4/0 실크 봉합사로 제자리에 묶습니다. 이제 빈 5밀리리터 주사기를 사용하여 기관 카테터를 통해 2밀리리터의 공기를 천천히 주입합니다. 폐에서 공기가 누출되지 않도록 10초 동안 공기를 유지합니다. 심장과 폐 엔드 블록을 제거합니다. 다음으로, 절제된 심폐 블록을 폐의 탈세포화를 위해 탈이온수가 들어 있는 직경 10cm의 플라스틱 페트리 접시로 옮깁니다. 블록을 섭씨 4도에서 1시간 동안 배양합니다. 배양 후 5밀리리터 주사기를 사용하여 기관 카테터를 통해 멸균 탈이온수 2밀리리터를 세 번 주입합니다. 폐가 반동할 때 액체가 빠져나갈 수 있도록 각 주사 후 일시 중지하십시오. 마찬가지로 폐동맥 카테터를 통해 2밀리리터의 물을 주입합니다. 2밀리리터의 0.1% Triton X-100 용액을 기관 및 폐동맥 카테터 모두에 주입합니다. 심폐 블록을 페트리 접시로 옮기고 섭씨 4도에서 밤새 Triton X-100 용액에서 정적으로 배양합니다. 다음날 폐에서 Triton X-100 용액을 제거하기 위해 기관 카테터와 폐동맥 카테터에 탈이온수 2ml를 주입하고 2% 데옥시콜레이트 용액 2ml로 반복합니다. 폐에서 데옥시콜레이트 용액을 제거한 후 1몰 염화나트륨 용액 2밀리리터를 기관 및 폐동맥 카테터 모두에 주입합니다. 심폐 블록을 1시간 동안 배양합니다. 탈이온수로 염화나트륨 용액을 제거한 후 DNase I 작업 용액 2밀리리터를 기관 및 폐동맥 카테터에 주입합니다. 심폐 블록을 1시간 동안 배양합니다. 멸균 PBS를 기관 및 폐동맥 카테터에 주입하여 DNase I 용액을 제거합니다. 탈세포화 후 폐의 가장자리가 흰색이고 투명한지 확인합니다. 내피 세포 성장 배지 2 또는 EGM-2 배양 배지 70밀리리터를 유리 용기에 넣고 실리콘 마개를 용기 위에 올려 밀봉합니다. 실리콘 마개, 유리 용기, 튜브가 있는 GL45 나사 캡, 250밀리리터 오토클레이브 유리병, 3방향 마개를 사용하여 미끼 피팅이 있는 L/S 14 튜브를 조립합니다. GL20 나사 캡의 실리콘 격막에 45게이지 바늘을 삽입합니다. 스톱콕 1과 3에 연결된 10밀리리터 주사기를 사용하여 튜브 A, B 및 C에 배양 배지를 채웁니다. 탈세포화된 심폐 블록의 폐동맥 카테터를 루어 피팅을 통해 튜브 C에 부착합니다. 카테터나 튜브에 기포가 없는지 확인하십시오. 중력 구동 내피 세포 주입의 경우 인간 제대 정맥 내피 세포(HUVEC)가 포함된 세포 저장소를 자기 교반기에 놓고 저장소가 장기실에서 30cm 위에 오도록 합니다. 마그네틱 교반기를 120RPM의 속도로 켭니다. 세포 현탁액이 튜브 A, 튜브 C 및 폐동맥 카테터를 통해 탈세포화된 스캐폴드로 흐르도록 활개콕 1과 2를 엽니다. 장기 배양의 관류를 위해 장기 챔버를 이산화탄소 인큐베이터에 넣으십시오. 맥동 펌프에 연결된 펌프 헤드에 튜브 B를 부착합니다. 인큐베이터 유리문을 닫습니다. 튜브가 도어와 고무 씰 사이에 올바르게 위치하는지 확인하십시오. 내피 세포가 스캐폴드 내에 정착할 수 있도록 탈세포화된 스캐폴드를 섭씨 37도에서 3시간 동안 배양합니다. 펌프를 6RPM의 속도로 시작하여 L/S 14 튜브를 사용하여 분당 2밀리리터의 배지 관류를 수행합니다. 배지 관류로 인해 탈세포화된 폐가 약간 확장되는 것을 관찰하십시오. 그런 다음 인큐베이터 문을 닫습니다. 매체 교체를 수행하려면 펌프 드라이브를 중지하십시오. 50밀리리터 멸균 주사기를 마개에 부착하고 챔버에서 50밀리리터의 배지를 빼냅니다. 또 다른 50밀리리터 멸균 주사기에 50밀리리터의 예열된 배지를 채웁니다. 용액을 유리 용기에 주입하고 마개쇠 3을 통해 매체를 챔버로 옮겨 마개가 적절하게 전환되도록 합니다. 박동 펌프를 다시 시작하십시오. 관류 장기 배양 2일 후 재집결된 심폐 블록을 수확합니다. 쥐의 폐는 탈세포화 후 흰색이고 반투명하게 보였는데, 이는 전체 폐 구조를 보존하면서 세포 성분이 제거되었음을 나타냅니다. 탈세포화된 마우스 폐의 조직학적 분석은 남아 있는 세포 성분이 없는 온전한 폐포 구조를 나타냈습니다. 관류 기반 생물반응기 배양 2일 후 7개의 HUVEC의 거듭제곱에 10의 3배로 재세포화된 마우스 폐는 HUVEC의 균일한 분포를 나타냈습니다. HUVEC는 말초 폐포 영역으로 이동하여 다시 집화된 폐에서 관찰된 바와 같이 모세혈관과 같은 네트워크를 형성했습니다.