Name: 번데기 제거 후 Drosophila Pupal 다리 발달의 장기 라이브 이미징 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-01-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 20 s
Description: 배우세요 Drosophila 번데기 다리 발달의 장기 라이브 이미징 방법을 통해 상피 세포의 역동적인 형태 변화와 Parthenon-like 구조 형성을 관찰하세요. 이 프로토콜은 초보자도 안정적으로 적용할 수 있습니다.

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<meta charset="utf8"></head><body>번데기가 없는 Drosophila Pupal Leg Morphogenesis의 확장된 라이브 이미징

<ol><li>Koto, A., Kuranaga, E., Miura, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+regulation+of+Drosophila+IAP1+determines+caspase+functions+in+sensory+organ+development%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Temporal regulation of Drosophila IAP1 determines caspase functions in sensory organ development.</a> J Cell Biol. 187 (2), 219-231 (2009).</li>
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<li>Ziserman, D., Roegiers, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live-cell+imaging+of+sensory+organ+precursor+cells+in+intact+Drosophila+pupae%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Live-cell imaging of sensory organ precursor cells in intact Drosophila pupae.</a> J Vis Exp. (51), e2706(2011).</li>
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<li>Weavers, H., Franz, A., Wood, W., Martin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+in+vivo+tracking+of+inflammatory+cell+dynamics+within+Drosophila+pupae%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Long-term in vivo tracking of inflammatory cell dynamics within Drosophila pupae.</a> J Vis Exp. (136), e57871(2018).</li>
<li>Kojima, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+mechanism+of+the+tarsus+in+insect+legs%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Insect+Sci%22%5BJournal%5D)">Developmental mechanism of the tarsus in insect legs.</a> Curr Opin Insect Sci. 19, 36-42 (2017).</li>
<li>Mirth, C., Akam, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Joint+development+in+the+Drosophila+leg%3A+Cell+movements+and+cell+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Joint development in the Drosophila leg: Cell movements and cell populations.</a> Dev Biol. 246 (2), 391-406 (2002).</li>
<li>Mirth, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ecdysteroid+control+of+metamorphosis+in+the+differentiating+adult+leg+structures+of+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Ecdysteroid control of metamorphosis in the differentiating adult leg structures of Drosophila melanogaster.</a> Dev Biol. 278 (1), 163-174 (2005).</li>
<li>Tajiri, R., Misaki, K., Yonemura, S., Hayashi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+shape+changes+of+ECM-producing+cells+drive+morphogenesis+of+ball-and-socket+joints+in+the+fly+leg%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Dynamic shape changes of ECM-producing cells drive morphogenesis of ball-and-socket joints in the fly leg.</a> Development. 137 (12), 2055-2063 (2010).</li>
<li>Hiraiwa, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unveiling+the+cell+dynamics+during+the+final+shape+formation+of+the+tarsus+in+Drosophila+adult+leg+by+live+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Genes+Evol%22%5BJournal%5D)">Unveiling the cell dynamics during the final shape formation of the tarsus in Drosophila adult leg by live imaging.</a> Dev Genes Evol. , (2024).</li>
<li>ImageJ plugin page. , Signaling RIKEN. Available at: 
 <a target="_blank" href="https://signaling.riken.jp/en/en-tools/imagej/629/">https://signaling.riken.jp/en/en-tools/imagej/629/</a> (2024).</li>
<li>Pandey, R., Heidmann, S., Lehner, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial+re-organization+and+dynamics+of+progression+through+mitosis+in+Drosophila+separase+complex+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Epithelial re-organization and dynamics of progression through mitosis in Drosophila separase complex mutants.</a> J Cell Sci. 118 (4), 733-742 (2005).</li>
<li>Kiehart, D. P., Galbraith, C. G., Edwards, K. A., Rickoll, W. L., Montague, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+forces+contribute+to+cell+sheet+morphogenesis+for+dorsal+closure+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Multiple forces contribute to cell sheet morphogenesis for dorsal closure in Drosophila.</a> J Cell Biol. 149 (2), 471-490 (2000).</li>
<li>Ashburner, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAshburner%2C+M+%22Drosophila%3A+A+Laboratory+Handbook%22">Drosophila: A Laboratory Handbook</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (1989).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>35 mm/유리 베이스 디쉬</td><td>IWAKI</td><td>3911-035</td><td></td></tr><tr><td>청소용 물티슈</td><td>NIPPON PAPER CRECIA</td><td>S-200</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #3c 집게</td><td>Fine Science Tools</td><td>11231-20</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5SF</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-00</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Research plus 2-20 &micro; L</td><td>Eppendorf</td><td>3123000098</td><td></td></tr><tr><td>플라이 스트레인: His2Av-mRFP, sGMCA</td><td>블루밍턴 초파리 재고 센터</td><td>59023</td><td></td></tr><tr><td>FV3000</td><td>EVIDENT</td><td></td><td>도립 컨포칼 현미경</td></tr><tr><td>FV31S-SW</td><td>EVIDENT</td><td></td><td>소프트웨어 FV3000</td></tr><tr><td>G40L</td><td>Shin-Etsu 실리콘</td><td></td><td>실리콘 그리스</td></tr><tr><td>마이크로 커버 유리 18 x 18 mm 0.13-0.17 mm</td><td>MATSUNAMI</td><td>C018181</td><td></td></tr><tr><td>마이크로 슬라이드 글라스 76 x 26 mm 0.9-1.2 mm</td><td>MATSUNAMI</td><td>S7213</td><td></td></tr><tr><td>NEO-SABLE 크기 0 라운드, 파인</td><td>펜텔</td><td>XZBNR-0</td><td>붓</td></tr><tr><td>SIL300CS-30CC</td><td>EVIDENT</td><td></td><td>실리콘 오일</td></tr><tr><td>실체 현미경 시스템 SZX7</td><td>EVIDENT</td><td></td><td></td></tr><tr><td>테루모 주사기 50 mL</td><td>테루모</td><td>SS-50ESZ</td><td></td></tr><tr><td>투명 양면 테이프</td><td>스카치&nbsp;</td><td>665-1-12</td><td>안쪽 층이 바깥 층보다 접착력이 강하기 때문에 번데기를 고정하려면 안쪽 층을 사용해야합니다.</td></tr><tr><td>UPLSAPO10x</td><td>EVIDENT</td><td></td><td></td></tr><tr><td>UPLSAPO40XS</td><td>EVIDENT</td><td></td><td>실리콘 침지 렌즈</td></tr><tr><td>Vannas Spring Scissors - 2.5mm 커팅 엣지</td><td>파인 사이언스 도구</td><td>15000-08</td><td>옵션</td></tr></tbody></table>

번데기 제거 후 drosophila pupal 다리 발달의 장기 라이브 이미징

Long-Term Live Imaging of Drosophila Pupal Leg Development After Puparium Removal

여기에서는 번데기 단계에서 발달 중인 초파리 성인 다리의 44시간 라이브 이미징의 예가 설명됩니다. His2Av-mRFP17 (표지핵) 및 sGMCA18 (GFP 표지 액틴 결합 단백질 Moesin, 표지 액틴)을 발현하는 파리를 흰 번데기 단계에서 수집하여 25°C에서 15시간 동안 배양했습니다. 번데기는 프로토콜에 따라 제거 및 장착되었습니다(그림 2). 다리 끝 부근에 있는 족근 및 척골의 Z 스택 이미지는 실온(엄격하지는 않지만 25°C에 가까운)에서 16시간에서 60시간 APF까지 15분마다 성공적으로 획득되었습니다. 일련의 이미지 중 전반부는 그림 3에, 후반부는 그림 4에, 전체의 영상은 영화 1에 표시되어 있습니다. 다리 조직이 급격히 좁아짐에 따라 상피 세포는 일시적으로 흥미로운 구조를 형성했는데, 파르테논 신전과 같은 구조는 apicobasal 돌기와 기저 연결을 특징으로 합니다(그림 3). 상피 두께의 감소는 윤곽이 거의 완성된 후에도 관찰되었습니다(그림 4). 전체 프로세스는 그림 1에 요약되어 있습니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67597/67597fig1.jpg"> 
그림 1: 번데기 단계에서 Drosophila 성인 족절의 최종 형태 형성에 대한 개요. 전체 과정은 장기간의 실시간 이미징 실험에서 관찰된 조직 및 세포 수준에서의 형태학적 변화를 기반으로 5단계로 나뉘었습니다. 여러 시점에 해당하는 대표 사진 또는 표면 렌더링 이미지(sGMCA 신호)가 왼쪽에 표시됩니다. 각 스테이지의 이벤트에 대한 간략한 설명은 오른쪽에 쓰여 있습니다. 이 그림은 Hiraiwa et al.15에서 수정되었습니다. 영화 1을 참조하십시오. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67597/67597fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67597/67597fig2.jpg"> 
그림 2: 라이브 이미징을 위한 번데기 제거 및 장착 어셈블리. (A) 접시에 담긴 흰 번데기. (B) 번데기는 25°C에서 15시간 동안 배양한 후 (A)에서 나타났습니다. 청록색으로 표시된 영역은 operculum을 나타냅니다. (C) 번데기가 양면 테이프에 붙어 있는 모습을 보여주는 사진. (D-J) 번데기 제거 절차를 보여주는 일련의 이미지. (D) 집게로 수술을 들어 올립니다. (E) 수술이 제거된 경우 (F) 번데기 표피와 번데기 사이에 집게 끝을 삽입합니다. (G) 번데기가 부분적으로 열려 있습니다. (H) 겸자 끝을 다시 삽입합니다. (I) 번데기가 열리고 뒤쪽 끝의 작은 부분만 남았습니다. (J) 붓으로 들어 올리는 번데기. (K) 번데기의 체액 누출의 예. 겸자 끝으로 찔린 상처에서 나오는 액체는 화살촉으로 표시됩니다. (L-N) 마운트 어셈블리를 보여주는 이미지 및 그림. (L) 유리 바닥 접시 바닥에 번데기와 증류수를 올려 놓은 것을 위에서 본 이미지. (M) 마운트 조립 완료 후의 접시. 유리 부분 주위의 가장자리를 따라 실리콘 그리스를 바르고 그리스에 커버 슬립을 놓아 밀봉했습니다. (N) 장기 라이브 이미징을 위한 Drosophila pupa의 장착 어셈블리의 개략도. (O) 기마 번데기가 거의 성체로 발달했습니다. (P) 탑재된 번데기 eclosing. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67597/67597fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67597/67597fig3.jpg"> 
그림 3: 16-27.5 h APF에서 족근 상피 세포의 동적 모양 변화.(A) 복부 쪽에서 본 번데기의 그림. 파선 사각형은 (B-E)에서 관찰된 영역에 해당합니다. L1: 첫 번째 다리, L2: 두 번째 다리, L3: 세 번째 다리. (B,C,D,E) 파리를 표현하는 sGMCA(녹색) 및 His2Av-mRFP(자홍색)에서 족절의 원위부의 라이브 이미징 스틸. 조직이 급격히 좁아지고 관절 부위의 움푹 들어간 곳이 진행됩니다. (B',C',D',E') 각각 (B,C,D,E)에서 파선으로 둘러싸인 영역의 확대. (C')의 화살표와 화살촉은 각각 apicobasal 투영의 예와 기저 연결의 위치를 보여줍니다. 파르테논 신전과 같은 구조는 (B')에서 형성되기 시작하고, (C')에서 완전히 형성되고, (D')에서 사라지기 시작하고, (E')에서는 보기 어려워집니다. 원위부는 모든 그림에서 오른쪽에 있고 등쪽은 맨 위에 있습니다. 스테이지는 (B,C,D,E)의 오른쪽 하단 모서리에 표시됩니다. 기준자: B,C,D,E: 50 μm; B',C',D',E': 10 μm. 이 그림은 Hiraiwa et al.15에서 수정되었습니다. 영화 1을 참조하십시오. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67597/67597fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67597/67597fig4.jpg"> 
그림 4: 41-60시간 APF에서 족근 상피 세포층의 모양 변화.(A,B,C,D) 그림 3과 동일한 실시간 이미징의 동일한 순차적 데이터 세트의 스틸 이미지. (A,B,C,D)의 파선 사각형은 각각 (A',B',C',D')로 확대됩니다. 약 48시간 APF(A-B')가 되면 강모, 발톱 및 풀빌리의 신장과 같은 외부 형상 형성이 거의 완료됩니다. 침범된 관절의 바닥은 근방으로 움직였고, 그 다음에는 약 54시간 APF 후에 볼-소켓 구조 형성이 진행되었습니다. 등쪽 상피와 복부 상피 사이의 형태학적 차이가 명백해졌습니다(B',C',D'의 이중 화살표와 열린 이중 화살표). 54시간 APF(C-D') 후 상피층은 분절의 윤곽을 거의 변경하지 않고 두께를 줄였습니다. 등쪽은 모든 그림에서 위쪽에 있고 오른쪽에 있습니다. 기준자: A,B,C,D: 50 μm; A',B',C',D': 20μm.이 수치는 Hiraiwa et al.15에서 인용되었습니다. 영화 1을 참조하십시오. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67597/67597fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67597/67597fig5.jpg"> 
그림 5: Bright Z 기능을 사용한 다리 관찰의 예. (A,B) Bright Z 기능을 사용하여 (B) 또는 (A) 없이 파리를 표현하는 sGMCA(녹색) 및 His2Av-mRFP(자홍색)의 세 번째 다리의 해당 영역, 깊이 및 단계의 이미지. (A) Bright Z 기능을 사용하지 않고 획득한 16시간 APF에서 세 번째 다리의 족골 영역 관찰에서 추출한 59.1μm 깊이의 XY 평면. (ᅡ') 횡단면 보기는 (A)의 노란색 수직선에 해당합니다. (A')의 수직선은 (A)의 초점면을 나타냅니다. (B) Bright Z 기능을 사용하여 획득한 16시간 APF에서 세 번째 다리의 족근 영역 관찰에서 추출한 61.6μm 깊이의 XY 평면. PMT 전압과 레이저 출력이 모두 조정되었습니다. (A)에 비해 이미지의 가시성이 향상되었습니다. (나') 단면도는 (B)의 노란색 수직선에 해당합니다. (B')의 노란색 수직선은 (B)의 초점면을 나타냅니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67597/67597fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 파일 1: 15-30시간 APF에서 다리 족근 영역의 실시간 이미징을 위한 컨포칼 현미경 설정의 예. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67597/67597_Supplementary%20File%201.docx" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
영화 1: 44시간 동안 부절의 원위부에 대한 장기 라이브 이미징. 파리를 표현하는 sGMCA(녹색)와 His2Av-mRFP(자홍색)를 사용하였다. 가장 대표적인 XY 평면은 그림 3 및 그림 4와 동일한 데이터 세트에서 추출되었습니다. 화살촉은 미래의 접합 영역의 예를 나타냅니다. 조직에서 빠르게 움직이는 세포는 대식세포와 같은 세포입니다. 족골 분절을 따라 뻗어 있는 끈 모양의 신호는 중격의 일부입니다. 타임스탬프는 hh: mm을 표시합니다. 원위부는 오른쪽에, 등쪽은 위쪽에 있습니다. 이 영화는 Hiraiwa et al.15<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67597/Movie%201.mp4" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>

번데기 제거 후 Drosophila Pupal 다리 발달의 장기 라이브 이미징

Over the past decades, significant progress has been made in understanding the mechanisms of cell fate determination. However, the process by which ...

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Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

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Mesoscopic 형광 tomography는 조직 sectioning 형광 현미경의 침투 제한없는 운영하고 있습니다. 이 기술은 다중 투영 조명 및 광자 수송 설명을 기반으로합니다. 우리의 morphogenesis의 인 - 생체내 전체 - 몸 3D 시각화 GFP - 표현에 날개 imaginal 디스크를...

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출처: Hellerman, M. B.,  et al.  Pupal Eye의 실시간 이미징. J. Vis. Exp. (2015){{TAG_ 28}}이 비디오는 Drosophila melanogaster 번데기의 눈 패턴을 연구하기 위한 실시간 이미징 기술을 보여줍니다. 녹색 형광 단백질(GFP) 태그 마커를 사용하면 발달 중인 눈 구조가 형성되는 동안 세포 조직 및 분화를 시각화할 수 있습니다.

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이 논문은 직접 번데기를 통해 이미지 세포 행동에 빠른 스캐닝 공 초점 현미경을 사용하는 방법을 보여줍니다. 그대로 번데기 경우를 떠남으로서,이 방법은 직접 공부하기 어려운 초파리 개발의 단계에서 관찰하고 역동적 인 세포 프로세스의 측정을 할 수 있습니다.

의 번데기 케이스를 통해서 영상<em&gt; 초파리</em

이 프로토콜은 살아있는 초파리 번데기 눈 신경 상피를 이미징하는 효율적인 방법을 제시합니다. 이 방법은 조직의 움직임과 불균일한 토폴로지를 보상하고, 여러 GFP 태그가 지정된 접합 단백질을 사용하여 세포 경계의 시각화를 향상시키며, 쉽게 조립할 수 있는 이미징 장비를 사용합니다.

의 라이브 영상 초파리 번데기 눈

이 프로토콜은 장기적인 ex vivo 배양과 Drosophila imaginal disc의 라이브 영상에 대한 상세한 방법을 설명합니다. 눈 디스크의 10 시간의 라이브 영상에서 광 수용체의 분화 및 구강 내 회전을 보여줍니다. 이 프로토콜은 간단하며 값 비싼 설정이 필요하지 않습니다.

장기의 라이브 영상<em&gt; 초파리</em&gt; 아이 디스크

여기, 우리 라이브 이미징 일반 및 근육-힘 줄 morphogenesis 개발 프로세스의 특히 생활에서 수행 하는 쉬운--사용 하 고 다양 한 방법 제시 초파리 번데기.

Vivo에서 근육-힘 줄 Morphogenesis 초파리 번데기에의 이미징

여기 우리는 vivo에서높은 spatio 시간적 해상도에서 라이브 이미징 상처 복구와 관련 된 염증 반응에 대 한 프로토콜을 제시. 이 메서드는 초파리 개발 장기 이미징 및 시간이 지남에 따라 특정 세포 인구의 추적을 가능 하 게 하의 번데기 단계를 활용 하 고 효율적인 RNAi 중재 유전자 비활성화와 호환 됩니다.

초파리 번데기 내에서 염증 성 세포 역학의 장기 Vivo에서 추적

이 프로토콜은 과일 파리가 변형을 겪으면서 Drosophila 복부 상피에서 세포 배향 및 조직 성장의 역학을 이미징 및 분석하기 위해 설계되었습니다. 여기에서 기술된 방법론은 Drosophila 또는 그밖 모형 유기체에 있는 다른 발달 단계, 조직 및 subcellular 구조물의 연구 결과에 적용될 수 있습니다.

푸팔 단계 동안 개발 초파리 에피텔리아에서 조직 방향 과 성장 역학의 이미징 및 분석

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LarvaSPA, 장기 시간 경과 이미징을 위한 초파리 유충을 장착하는 방법

여기에서는 초파리 난소 틈새 시장에서 생식세포 줄기세포(GSC)의 비대칭 분열에 대한 실시간 이미징을 수행하기 위한 자세한 프로토콜을 제공합니다. 우리는 분광 단백질 Par-1의 녹색 형광 단백질(GFP) 융합을 유비쿼터스하게 발현하는 형질전환 라인을 사용합니다.

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배우세요 Drosophila 번데기 다리 발달의 장기 라이브 이미징 방법을 통해 상피 세포의 역동적인 형태 변화와 Parthenon-like 구조 형성을 관찰하세요. 이 프로토콜은 초보자도 안정적으로 적용할 수 있습니다.

번데기 제거 후 Drosophila Pupal 다리 발달의 장기 라이브 이미징

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