Name: 유전자 기능 연구를 위한 sliced human cortical organoids의 Electroporation (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-11-29T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 13 s
Description: 배우세요 인간 대뇌 오가노이드의 전기천공 기술을 활용한 유전자 기능 연구 방법입니다. 신경전구세포 분화와 신경발달장애 메커니즘 이해에 활용할 수 있습니다.

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<meta charset="utf8"></head><body>전기천공법을 통한 얇게 썬 인간 피질 오가노이드의 CRISPR/Cas9 유전자 녹아웃

<table><tbody><tr><td>15mL PP 원심분리기 튜브, 원뿔형</td><td>Corning</td><td>430791</td><td></td></tr><tr><td>4D-Nucleofector 코어 유닛</td><td>Lonza</td><td></td><td></td></tr><tr><td>4D-Nucleofector X 유닛</td><td>Lonza</td><td></td><td></td></tr><tr><td>5mL 폴리스티렌 라운드 바텀 튜브(셀 스트레이너 캡 포함</td>) <td>Corning</td><td>Falcon 352235</td><td></td></tr><tr><td>6웰 플레이트, nunclon 처리</td><td>Thermo Fisher</td><td>140675</td><td>hiPSC용 배양</td></tr><tr><td>6웰 플레이트, 초저 부착</td><td>Corning</td><td>3471</td><td>오가노이드 배양용</td></tr><tr><td>A83-01</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>72022</td><td>Forebrain medium 1 (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15</td></tr><tr><td>Air 압축기</td><td>Aerotec</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Chicken IgY (IgG) (H+L)</td><td>Jackson Immuno Research</td><td>703-545-155</td><td>2차 항체, RRID: AB_2340375; 희석 1:1000</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 555 Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)</td><td>Invitrogen</td><td>A-31572</td><td>2차 항체, RRID: AB_162543; 희석 1:1000</td></tr><tr><td>Alt-R CRISPR-Cas9 crRNA, 2 nmol</td><td>통합 DNA 기술</td><td></td><td>맞춤형 설계(2 nmol로 주문)</td></tr><tr><td>Alt-R CRISPR-Cas9 tracrRNA</td><td>통합 DNA 기술</td><td>1072532</td><td>5 nmol</td></tr><tr><td>Alt-R S.p. HiFi Cas9 Nuclease V3</td><td>통합 DNA 기술</td><td>1081060</td><td>100 &micro; g, Streptococcus pyogenes</td></tr><tr><td>Amphotericin B (Fungizone)</td><td>Gibco</td><td>15290018</td><td>Forebrain 배지 2, 3 및 4&nbsp; (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15</td></tr><tr><td>Anti-GFP 1차 항체 (닭, 다클론성)</td><td>Abcam</td><td>ab13970</td><td>RRID: AB_300798; 희석 1:2000</td></tr><tr><td>Anti-PCGF4 1차 항체 (마우스, 단클론)</td><td>Millipore</td><td>05-637&nbsp;</td><td>RRID: AB_309865; 희석 1:300</td></tr><tr><td>ApoTome 형광 현미경</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ascorbic Acid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>1043003</td><td>Forebrain medium 4&nbsp; (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15</td></tr><tr><td>B27-보충제 (+ 비타민 A)</td><td>Gibco</td><td>17504044</td><td>Forebrain medium 3, 4&nbsp; &nbsp; (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15</td></tr><tr><td>Banana to Micrograbber Cable Kit</td><td>Harvard Apparatus BTX</td><td>45-0216</td><td></td></tr><tr><td>Biometra TRIO-Thermocycler (PCR machine)</td><td>Analytik</td><td>Jena 846-2-070-723</td><td></td></tr><tr><td>Capillaries, filament with borosilicate glass, OD 1.2 mm; ID 0.69 mm; 10cm 길이</td><td>Science Products</td><td>BF120-69-10</td><td>특정 두께로 당겨야 함</td></tr><tr><td>CHIR-99021</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>72052</td><td>Forebrain 매체 2&nbsp; (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15</td></tr><tr><td>Collagenase Type IV</td><td>Gibco</td><td>17104019</td><td></td></tr><tr><td>CRTDi004-A</td><td>Stem Cell Engineering Facility at CMCB DD</td><td>https://hpscreg.eu/cell-line/CRTDi004-A</td> 건강한 기증자 DAPI Roche 10236276001 1 mg/mL stock<td>의 단일 세포 적응 hiPSC 라인</td></tr>, IF Dibutyryl-cAMP<tr><td></td><td></td><td></td><td>에 1:1000 희석 사용</td></tr><tr><td></td><td>STEMCELL Technologies</td><td>73884</td><td>포브레인 매체 4&nbsp; (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15</td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12, HEPES</td><td>Fisher Scientific</td><td>31330095</td><td>Forebrain medium 1, 2, and 3&nbsp; (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15</td></tr><tr><td>Dorsomorphin</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>72102</td><td>포브레인 매체 1&nbsp; (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15</td></tr><tr><td>Dumont #55 집게, 해협, 11cm</td><td>정밀 과학 도구</td><td>11295-51</td><td></td></tr><tr><td>ECM 830 구형파 전기천공법 시스템</td><td>Harvard Apparatus BTX</td><td>45-2052</td><td></td></tr><tr><td>에탄올</td><td>Sigma Aldrich</td><td>32205-1L-M</td><td></td></tr><tr><td>에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)</td><td>시그마 Aldrich</td><td>EDS-500G</td><td></td></tr><tr><td>패스트 그린 FCF</td><td>시그마 알드리치</td><td>F7252</td><td></td></tr><tr><td>태아 소 세럼 (FBS)</td><td>GE 헬스케어&nbsp;</td><td>SH30070.03&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>화염/갈색 마이크로피펫 풀러</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>P-97</td><td>미세모세관 당기기용</td></tr><tr><td>Geneious Prime</td><td>GraphPad Software LLC dba Geneious</td><td>Software 버전 2024.0.5</td><td></td></tr><tr><td>gLACZ</td><td>Kalebic et al., 2016; Platt et al., 2014</td><td></td><td>5'-TGCGAATACGCCCACGCGATCGG; 밑줄이 그어진 뉴클레오티드 = PAM</td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Gibco&nbsp;</td><td>35050038</td><td>Forebrain medium 1, 2, 3, and 4 (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15</td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G8898</td><td></td></tr><tr><td>gPCGF4 KO1</td><td>이 논문</td><td></td><td>5'-TGAACTTGGACATCACAAATAGG (그림 3I+J의 KO 이미지에 해당)</td></tr><tr><td>gPCGF4 KO2</td><td>이 논문</td><td></td><td>5'-ACAAATAGGACAATACTTGCTGG (KO에 해당) 그림 3I+J)</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>made in house</td><td></td><td>1 M stock</td></tr><tr><td>Horse Serum, heat-inactivated</td><td>Gibco</td><td>26050088</td><td></td></tr><tr><td>Human GDNF Recombinant</td><td>Protein Thermo Fisher</td><td>450-10</td><td>Forebrain medium 4&nbsp; (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15</td></tr><tr><td>Human/Mouse/Rat BDNF 재조합 단백질</td><td>Thermo Fisher</td><td>450-02</td><td>Forebrain 매체 4&nbsp; (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15</td></tr><tr><td>염산(HCl)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>258148</td><td>TrisHCl</td></tr><tr><td>ImmEdge(왁스) Pen</td><td>Vector Laboraories</td><td>H-4000</td><td></td></tr><tr><td>인슐린 용액 인간</td><td>Sigma Aldrich</td>를 만들기 위해<td>&nbsp; I9278</td><td>포브레인 미디엄 3&nbsp; (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15</td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2618-1</td><td></td></tr><tr><td>Knockout Serum Replacement</td><td>Gibco&nbsp;</td><td>10828-010</td><td>전뇌 매체 1&nbsp; (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15</td></tr><tr><td>Laser 스캐닝 컨포칼 980 현미경</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Low Melting Point Agarose, 초순수</td><td>Thermo Fisher</td><td>16520100</td><td>진동 절편 중 hCO 포매ing용</td></tr><tr><td>Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) 기저 멤브레인 매트릭스, LDEV-free</td><td>Corning</td><td>354230</td><td>오가노이드 배양용</td></tr><tr><td>Matrigel hESC 인증 매트릭스, LDEV-free</td><td>코닝</td><td>354277</td><td>HiPSC 배양</td></tr><tr><td>MgCl2, 1 M</td><td>Thermo Fisher</td><td>AM9530G</td><td></td></tr><tr><td>Microinjector PicoPump + Foot Switch</td><td>World Precision Instruments</td><td>SYS-PV820</td><td></td></tr><tr><td>Microloader 피펫 팁 0.5 to 20 &micro; L</td><td>Eppendorf</td><td>5242956003</td><td>유리 모세관 로딩용</td></tr><tr><td>Mowiol 4-88</td><td>Sigma Aldrich</td><td>81381</td><td></td></tr><tr><td>mTeSR 1</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>85850</td><td>줄기세포 매체</td></tr><tr><td>N-2 보충제</td><td>Gibco</td><td>17502048</td><td>Forebrain 매체 2, 그리고 3&nbsp; (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>시그마 Aldrich</td><td>S5886</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>시그마 Aldrich</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>NEB 다음 고화질 2x PCR 마스터믹스&nbsp;</td><td>New England Biolabs</td><td>M0541S</td><td></td></tr><tr><td>Neubauer 계수실</td><td>브랜드</td><td>718605</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal 매체</td><td>Gibco</td><td>21103049</td><td>Forebrain 매체 4&nbsp; (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15</td></tr><tr><td>비필수 아미노산</td><td>Gibco&nbsp;</td><td>11140050</td><td>Forebrain medium 1, 2, 3 및 4 (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15</td></tr><tr><td>Nuclease-Free Duplex Buffer</td><td>통합 DNA 기술</td><td>1072570</td><td></td></tr><tr><td>O. C. T. Compound</td><td>Tissue-Tek</td><td>4583</td><td>동결 조직 표본</td></tr><tr><td>P3 기본 세포 4D-Nucleofector X Kit S</td><td>Lonza</td><td>V4XP-3032</td><td></td></tr><tr><td>파라포름알데히드</td><td>피셔 케미컬</td><td>P/0840/53</td><td></td></tr><tr><td>pCAG-GFP</td><td>Addgene</td><td>11150</td><td></td></tr><tr><td>필-어-웨이 임베딩 몰드 TruncatedT12</td><td>Polysciences Inc.</td><td>18986-1</td><td>진동 및 동결 절편을 위한 hCO 임베딩용</td></tr><tr><td>페니실린-스트렙토마이신(10,000 U/mL)&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td>Forebrain 매체 1, 2, 3, 4&nbsp; (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15 및 핵 제거 후 줄기 세포 배지용</td></tr><tr><td>페트리 접시 60mm x 15mm, 통풍구 없음, 멸균</td><td>Corning</td><td>BP50-02</td><td></td></tr><tr><td>페트리 접시 백금 전극 챔버, 5mm 간격</td><td>Harvard Apparatus BTX</td><td>45-0504</td><td></td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수(PBS)</td> <td>사내</td><td></td><td></td></tr><tr><td>단백질 분해 효소 K</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P2308</td><td>Titrachium 앨범에서; 10 mg/mL 주식</td></tr><tr><td>QIAquick 젤 추출 키트</td><td>Qiagen</td><td>28706</td><td></td></tr><tr><td>RHO/ROCK 경로 억제제 (Y-27632)</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>72308</td><td></td></tr><tr><td>SB-431542</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>72232</td><td>Forebrain 매체 2&nbsp; (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15</sup</td></tr><tr><td>>Sodium Citrate Dihydrate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>W302600-1KG-K</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L3771</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S7903</td><td></td></tr><tr><td>SuperFrost Plus 접착 슬라이드</td>, <td></td><td>KL</td> 300 LED가 있는 Fisher Scientific 10149870 <td></td></tr><tr><td>SZX10</td> 올<td>림푸스</td><td>SZX10</td><td>또는 대체 스테레오스코프</td></tr><tr><td>Thermo Shaker</td><td>Grant bio</td><td>PSC24N</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T9284</td><td>일명 Octoxinol 9</td></tr><tr><td>Trizma base</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T1503</td><td>TrisHCl</td></tr><tr><td>Trypan Blue Solution을 만들기 위해 0.4%</td><td>Thermo Fisher</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Express Enzyme (1x)</td><td>Thermo Fisher</td><td>12604021</td><td>Dissociation enzmye 단일 세포 현탁액</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P1379</td><td>일명 폴리소르베이트 20</td></tr><tr><td>Tyrode's salt</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T2145-10x1l</td><td></td></tr><tr><td>진동 마이크로톰(비브라톰)</td><td>Leica</td><td>VT1200 S</td><td></td></tr><tr><td>Wide-Bore 1000 &micro; L 유니버설 핏 필터 팁</td><td>Corning</td><td>TF-1005-WB-R-S</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-Mercaptoethanol</td><td>Gibco&nbsp;</td><td>21985-023</td><td>전뇌 매체 1, 3 및 4&nbsp; (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15</td></tr></tbody></table>

유전자 기능 연구를 위한 sliced human cortical organoids의 electroporation

Electroporation of Sliced Human Cortical Organoids for Studies of Gene Function

CRISPR/Cas9 매개 유전자 절제는 gRNA의 설계를 필요로 합니다. 일반적으로 7-11 bp 간격으로 배치된 한 쌍의 gRNA를 가진 관심 유전자의 첫 번째 엑손 중 하나를 표적으로 하는 것이 효과적입니다(3 bp의 배수는 피함). 첫 번째 테스트로서, gRNA에 의한 템플릿 인식의 효율성은 PCR 템플릿 26,40,62를 사용하여 시험관 내에서 조사할 수 있습니다. 효율적인 표적화 및 Cas9 매개 절단은 템플릿 DNA의 감소와 아가로스 겔에서 절단된 DNA 산물의 출현에서 볼 수 있습니다(그림 1B). 추가적인 gRNA 검사는 피질 오가노이드 생성에 사용되는 iPSC 라인에서 수행될 수 있습니다. 이를 위해서는 iPSC의 핵 절제가 필요하며, 이는 성공적인 형광 리포터 발현으로 시각화할 수 있습니다(그림 1C). 관심 부위의 효율적인 표적화는 Sanger 염기서열분석(Sanger sequencing)을 통해 확인할 수 있으며, 그 결과 크로마토그램이 갑자기 종료되거나 표적 부위 주위에 겹쳐지게 되며(그림 1D), 이는 비상동 말단 결합66에 의한 이중 가닥 파손 복구로 인한 indels 스펙트럼에서 비롯됩니다. in vitro 및 in iPSC 세포에서 가이드 RNA 효율 검사는 피질 오가노이드에서 유전자 절제를 위한 효율적인 gRNA 쌍을 선택하는 데 도움이 됩니다.
전기천공법 전에 피질 오가노이드를 절편화하여 전기천공법 혼합물 주입을 위한 심실 내강을 식별할 수 있도록 지원합니다(그림 2A-C). 그런 다음 주입된 오가노이드는 전기천공(electroporation) 챔버로 전달됩니다(그림 2D). 전기천공술을 위해서는 심실과 같은 구조가 잘 발달된 피질 오가노이드를 사용해야 하며(그림 2E), 눈에 보이는 구조가 없는 피질 오가노이드는 버려야 합니다(그림 2F). 전기천공법 혼합물에는 시술 중에 주입된 심실을 시각화할 수 있는 염료가 포함되어 있습니다(그림 2G). 배양에서 1-3일 후, 형광 현미경에서 네이티브 GFP 신호로 성공적으로 표적화된 심실을 볼 수 있습니다(그림 2H).
심층적인 조직학적 분석을 위해 냉동 절편의 면역조직화학을 수행할 수 있습니다. 이상적으로는, 여러 개의 표적 심실이 전기천공된 피질 오가노이드 내에 존재합니다(그림 3A,B). 가장 최적의 전기천공법은 외부를 향하는 오가노이드의 바깥쪽 영역에 있는 심실과 같은 구조를 대상으로 하는데(그림 3C), 이는 일반적으로 가장 확장된 심실이기 때문입니다. 경우에 따라 전기천공법은 과도한 세포 사멸을 초래할 수 있습니다(그림 3D,E), 예를 들어 플라스미드 농도가 너무 높거나 전기천공법 설정이 최적이 아닌 경우). 오가노이드의 내부를 향하는 전기천공법(그림 3F)은 종종 외부에 비해 심실과 같은 구조의 덜 확장된 영역을 포함합니다. 우리의 경험에 비추어 볼 때, 변동성을 줄이기 위해 오가노이드의 정의된 영역에 정량 분석을 집중하는 것이 도움이 됩니다. 때때로, 전기천공법은 정점 표면의 파괴를 유발할 수 있습니다(그림 3G), 예를 들어 주입량이 너무 높아 심실이 파열되거나 전기 펄스가 너무 강하여 세포 박리로 이어질 수 있습니다. 마지막으로, 인접한 두 개의 심실이 표적이 될 때(그림 3H), 피질 영역의 경계와 표적 세포의 기원을 할당하는 것이 어려워질 수 있습니다.
면역조직화학은 관심 세포의 단백질 수준에서 성공적인 CRISPR/Cas9 매개 knockout을 확인하는 데 사용할 수 있으며(그림 3I), 여기서는 PRC1(Polycomb Repressive Complex 1) 단백질 PCGF467을 표적으로 하여 예시합니다. 신호 강도는 대조군 대 실험 조건에서 GFP 양성 세포에서 분석할 수 있습니다(그림 3J). 대안적으로, 적절한 항체를 이용할 수 없는 경우, 표적 세포는 피질 오가노이드(cortical organoids)60 로부터 FACS로 분리하고 Sanger 또는 Next Generation Sequencing36에 의해 추가 분석할 수 있습니다. 또한, 단백질 수준의 감소는 웨스턴 블로팅(Western blotting)을 사용하여 분석할 수도 있습니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67598/67598fig1v5.jpg"> 
그림 1: 급성 CRISPR/Cas9 매개 유전자 녹아웃에 대한 가이드 RNA 설계 및 검증. (A) 관심 유전자의 엑손을 표적으로 하는 두 개의 gRNA가 있는 가이드 RNA(gRNA) 설계 전략의 개략도. 검은색 화살표는 gRNA 검증에 사용되는 템플릿 준비를 위한 PCR 프라이머를 나타냅니다. (B) in vitro에서 gRNA 효율 검증. PCR 증폭 주형을 RNP 복합체로 절단하였다. 성공적인 cleavage가 이루어지면 gel 전기영동 후 크기가 다른 두 개의 band가 보이는 반면(왼쪽), low-efficiency gRNA의 경우 template이 절단되지 않은 상태로 유지됩니다(오른쪽). (C) RNP 복합체와 GFP 플라스미드로 핵 절제술 3일 후 인간 유도 만능 줄기세포(hiPSC)의 명시야 이미지(왼쪽), GFP 형광(가운데) 및 병합 이미지(오른쪽). 스케일 바: 350 μm. (D) GFP 양성 세포에서 증폭된 DNA의 Sanger 염기서열분석을 통한 hiPSC의 gRNA 효율 검증. 이중 가닥 DNA의 성공적인 절단이 이루어지면 염기서열분석 트랙은 gRNA 타겟 부위(상단, KO1)에서 시작하여 중첩된 신호를 보여줍니다. 표적화에 실패한 경우, DNA 염기서열 추적은 LACZ 대조군과 비교하여 변하지 않은 상태로 유지됩니다(하단, KO2). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67598/67598fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67598/67598fig2v5.jpg"> 
그림 2: 절단된 인간 피질 오가노이드의 전기천공법. (A) 인간 피질 오가노이드(hCOs)의 전기천공을 위한 워크플로우를 보여주는 개략도. 먼저 hCO를 500μm 두께의 슬라이스로 절단합니다. 2일 후, GFP 발현 플라스미드와 패스트 그린을 함유하는 RNP 믹스를 hCO의 외부 영역에 우선적으로 심실 유사 구조의 루멘에 주입합니다. 전기천공을 위해 hCO를 전기천공(electroporation) 챔버에 넣습니다. 며칠 간의 배양 후 전기천공된 영역에서 GFP 신호를 감지할 수 있습니다. (B) hCO의 진동 절편 이미지. 오가노이드는 블록의 배지에 있는 3% 저융점 아가로스에 내장되어 있습니다(왼쪽). 블록은 500μm 두께의 슬라이스(가운데)로 절단됩니다. 얇게 썬 오가노이드는 넓은 구멍의 피펫 팁(오른쪽)을 사용하여 배양 접시로 다시 옮겨집니다. (C) RNP, pCAG-GFP 및 0.1% Fast Green을 함유한 혼합물을 오가노이드의 심실 유사 구조에 주입한 이미지를 보여줍니다. 오가노이드는 Tyrode의 용액에 잠기고 얇은 유리 모세관은 심실 유사 구조 중심의 내강에 삽입됩니다(왼쪽). 겸자는 오가노이드(왼쪽 및 중간)를 안정화하는 데 사용됩니다. 오가노이드 바깥쪽의 심실은 표적(중앙)입니다. 주입된 오가노이드는 전기천공(electroporation) 챔버 또는 나중에 넓은 구멍의 피펫 팁(오른쪽)을 사용하여 배양 접시로 옮겨집니다. (D) 유리 페트리 접시와 유리에 접착된 두 개의 금속 블레이드로 구성된 전기천공실 이미지. 금속 블레이드는 전극 역할을 하며 전기천공기에 연결하기 위해 케이블을 부착하기 위한 구멍이 있습니다. 녹색 그림자를 통해 볼 수 있는 hCO의 주입된 면은 양극(양극, 빨간색 케이블)(오른쪽)을 향해야 합니다. (E) 잘 발달된 심실과 같은 구조를 보여주는 hCO의 대표 이미지. 더 가벼운 고리는 심실 영역과 같은 영역을 나타냅니다. 심실과 같은 구조의 중앙에 있는 더 어두운 원은 내강을 나타내며 주사 대상이어야 합니다. (F) 잘 발달된 심실과 같은 구조가 없는 hCO의 대표적인 이미지로, 추가 실험을 위해 포함하지 않는 것이 좋습니다. (G) 전기천공법 혼합물 주입 후 hCO의 대표적인 이미지로, 대상 영역이 Fast Green(주황색 화살표)으로 보입니다. (H) 전기천공법 24시간 후 네이티브 GFP 신호를 보여주는 hCO의 대표 이미지. 스케일 바: 100μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67598/67598fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67598/67598fig3v5.jpg"> 
그림 3: 전기천공된 절삭된 인간 피질 오가노이드의 면역조직화학적 분석.(A) 녹색 형광 신호로 전기천공된 인간 피질 오가노이드(hCO)를 나타내는 개략도. (B) 전기천공 후 7일 동안 다중 전기천공된 심실을 가진 동결절제된 hCO의 GFP(녹색)에 대한 DAPI 염색(회색) 및 면역형광. (C-H) GFP(녹색) 및 핵(DAPI, 회색)으로 염색된 다양한 전기천공법 결과의 예시 이미지. (C) 온전한 핵(삽입 1, D 참조), 중단되지 않은 뇌실과 같은 구조, 일반적으로 가장 확장되는 오가노이드의 바깥쪽을 향하는 영역의 전기천공된 세포를 가진 최적의 전기천공. (E) 작고, DAPI 밀도가 높고, 왜곡된 핵을 특징으로 하는 전기천공된 영역(삽입 2, D 참조)에서 대량의 세포 사멸을 나타내는 hCO의 예. (F) 오가노이드 내부를 향하는 성공적인 전기천공법으로, 피질 플레이트와 같은 영역이 인접한 심실과 합쳐지기 때문에 해석하기가 더 어려운 경우가 많습니다. (G) 전기천공된 영역의 중앙에서 파괴된 심실과 같은 구조(주황색 화살표). (H) 부분적으로 병합되어 정량화하기 어려운 여러 개의 작은 심실을 포함하는 hCO의 예. (I) CRISPR/Cas9 매개 녹아웃에 대한 LACZ(gLACZ KO, 왼쪽) 또는 PCGF4(gPCGF4 KO, 오른쪽)를 표적으로 하는 RNP 복합체의 전기천공 7일 후 GFP(녹색) 및 PCGF4(자홍색)에 대한 DAPI 염색(회색) 및 면역형광. 동그라미 모양의 세포는 PCGF4의 강도 감소를 강조하여 성공적인 유전자 절제를 나타냅니다. LACZ 컨트롤(왼쪽)에서 균일한 신호를 볼 수 있습니다. (J) 그래프는 gLACZ 조건에서 PCGF4 발현 중앙값에 대한 대조군(gLACZ KO) 및 PCGF4의 KO(gPCGF4 KO)에 대한 GFP 양성 세포에서 면역형광 후 정량화된 PCGF4 강도를 보여줍니다. 각 점은 셀을 나타냅니다. 동일한 hiPSC 라인의 두 가지 다른 배치(회색 및 검은색)에서 3-4개의 오가노이드 데이터. p &lt; 0.0001, Mann-Whitney 검정. 모든 이미지는 레이저 스캐닝 컨포칼(B, C) 또는 형광(E-I) 현미경으로 획득했습니다. 이미지는 10-15μm 두께의 z-스택의 최대 강도 투영을 나타냅니다. 흰색 점선은 심실 내강을 향하는 정점 표면과 hCO의 외부 표면을 나타냅니다. 주황색 점선은 병합된 심실의 VZ/SVZ 경계를 나타냅니다. 스케일 바: 100μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67598/67598fig03large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>항체/염료</td>
			<td>희석</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>닭고기 안티 GFP</td>
			<td>1:2,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>마우스 안티 PCGF4</td>
			<td>1:300</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 당나귀 안티 치킨</td>
			<td>1:1,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 555 당나귀 안티 래빗</td>
			<td>1:1,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>다피</td>
			<td>1 mg/mL 재고; 1:1,000</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
표 1: 면역형광 염색에 사용되는 항체 및 염료 및 그 희석 목록.

유전자 기능 연구를 위한 sliced human cortical organoids의 Electroporation

Human cortical organoids have become important tools for studying human brain development, neurodevelopmental disorders, and human brain evolution. ...

electroporation-sliced-human-cortical-organoids-for-studies-gene

Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

이 절차 또는 나선 limbus 및 나선 신경절의 뉴런없이 Corti의 murine 기관의 격리와 문화에 대한 방법을 설명합니다. 우리는 또한 electroporation에 의해 Corti explant의 기관에서 외인성 리포터 유전자의 표현 방법을 보여줍니다.

차 문화와 Corti의 Murine 오르간의 플라스미드 Electroporation.

utero의 electroporation에서 생체내에의 연결 전구 세포를 transfecting위한 가치있는 방법입니다. 전극과 electroporation의 발달 timepoint의 위치에 따라, 피질 세포의 특정 하위 집합을 타겟팅할 수 있습니다. 타겟 세포는 다음 생체내 또는 유전 변경의 효과에 대한 체외에서 분석할 수 있습니다.

utero에서 Electroporation은 두피 뉴런의 하위 집합의 유전자 기능을 학습에 대한 기본의 연결을 문화 뒤에

대뇌 피질의 발달에서 유전자의 기능의 신속한 평가를 실시하기 위해, 우리는 관련된 방법을...

의 연결을 Morphogenesis의 연구를위한 방법 :<em&gt; 예 생체내</em배아 Murine 대뇌 피질에서&gt; RNAi의 Electroporation

이 비디오는 다양한 체외 해마 절편 배양에서 흥분성 및 억제성 뉴런 모두에 있는 유전자의 단세포 전기천공을 위한 프로토콜을 보여줍니다. 이 기술은 세포 자율 메커니즘 및 시냅스 전달 단백질 상호 작용을 포함하여 뉴런의 특정 분자 및 생리학적 기능을 검사하는 데 유용합니다.

Organotypic Brain Slice Cultures의 Single Cell Electroporation: An In Vitro Technique to Deliver Plasmids inside Targeted Neurons in Brain Hippocampal Slices(유기형 뇌 슬라이스 배양에서의 단세포 전기천공법: 뇌 해마 슬라이스의 표적 뉴런 내부에 플라스미드를 전달하는 체외 기술)

이 프로토콜은 관련 개선 explant 절차를...

예 자궁 Electroporation 및 전체 반구의 Explants : 초기 두피 개발 연구 간단한 실험 방법

자궁 전기기화의 이중은 공간적으로 그리고 일시적으로 분리되는 세포 집단을 표적으로 할 수 있습니다. 이 기술은 정상 조건에서 형광 단백질을 사용하여 그 세포 인구 사이 상호 작용을 구상하는 데 유용하지만 기능적 실험 후 관심의 유전자를 어지니로 조정합니다.

자궁에서 두 배의 자궁 전기화는 시간적으로 그리고 공간적으로 분리된 세포 인구를 표적으로 합니다

여기에 제시된 단세포 전기기화는 체외 해마 슬라이스 배양 연령의 범위에 걸쳐 흥분성 및 억제 뉴런 모두에서 유전자를 전달할 수 있는 프로토콜입니다. 우리의 접근은 개별 적인 세포에 있는 유전자의 정확하고 능률적인 발현을 제공합니다, 세포 자율및 세포 간 기능을 검토하기 위하여 이용될 수 있는.

마우스 해마 흥분및 직업 별 억제 신경의 다른 organotypic 슬라이스 문화에 걸쳐 단세포 전기화

영장류 대뇌 오가노이드의 전기천공법은 영장류(병리)생리학적 신피질 발달에 가까운 모델 시스템에서 다양한 전구체 유형과 뉴런에 일시적인 유전자 변형을 도입하는 정확하고 효율적인 접근 방식을 제공합니다. 이를 통해 신경 발달 및 진화 과정을 연구 할 수 있으며 질병 모델링에도 적용 할 수 있습니다.

유전자 변형을 위한 영장류 대뇌 오가노이드의 표적 미세주입 및 전기천공

배아 병아리 망막 세포 배양은 광 수용체 생물학의 연구에 유용한 도구를 구성한다. 우리는 이전에 배양 망막의 플라스미드 일렉트로 오보 EX에 기초한 효율적인 유전자 전달 기술을 개발했다. 이 기술은 상당히이 시스템에 대한 가능한 유전자 조작을하고, 현재 사용 가능한 프로토콜을 통해 형질 전환 효율을 증가시킨다.

차 세포 배양 연구 병아리 망막에 효율적인 유전자 전송 : 전 비켜 Electroporation에 접근

우리는 배아 쥐 내이에서 달팽이관 이식의 격리 및 배양을 설명하는 방법을 제시합니다.  또한 구형파 전기천공법을 통해 달팽이관 이식으로 유전자를 전달하는 방법을 보여줍니다. 유전자 전달 기술과 결합된 체외 이식 배양을 통해 연구자들은 발달 중 유전자 발현 변경의 영향을 연구할 수 있습니다.

Electroporation에 의한 배아 마우스 달팽이의 Explants의 문화 유전자 전송

배우세요 인간 대뇌 오가노이드의 전기천공 기술을 활용한 유전자 기능 연구 방법입니다. 신경전구세포 분화와 신경발달장애 메커니즘 이해에 활용할 수 있습니다.

유전자 기능 연구를 위한 sliced human cortical organoids의 Electroporation

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