Purification, Expansion, and Flow Cytometry-Based Phenotyping of Mouse Derived Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells

우리의 연구는 균질한 마우스 골수 중간엽 줄기 세포를 정제하고 확장하는 저비용 방법을 제공합니다. 이는 연구자들이 강력한 성장 및 분화 능력을 갖춘 충분한 고품질 세포를 얻는 데 도움이 됩니다. 골수 줄기 세포 연구의 주요 과제는 골수 중간엽 줄기 세포를 분리하기 위한 간단하고 효과적인 프로토콜을 개발하는 것입니다. 이 방법을 사용하면 골수 중간엽 줄기 세포가 교란을 피하여 측면으로 성장할 수 있습니다. 세 번째 계대를 사용하고, 추가적인 성장 효과를 피하고, 조혈 세포를 주변에 유지하여 줄기 세포의 건강과 기능을 지원합니다.

[강사] 시작하려면 안락사된 마우스를 75% 에탄올에 5분 동안 담그십시오. 멸균 해부 가위를 사용하여 아킬레스건 근처의 뒷다리에 약 1cm 절개합니다. 그런 다음 뒷다리 주위를 원형 절개하여 원위 경골을 노출시킵니다. 절개 부위의 피부를 엉덩이 쪽으로 위쪽으로 벗겨 양쪽 뒷다리의 피부를 제거합니다. 장골을 따라 절단하여 엉덩이 뼈에서 대퇴골두를 분리합니다. 멸균 메스를 사용하여 경골과 비골에서 가능한 한 많은 힘줄과 근육을 제거하여 나중에 홍조를 쉽게 합니다. 세척된 뼈를 멸균 후드로 옮기기 전에 2% 페니실린과 스트렙토마이신이 함유된 PBS가 들어 있는 접시에 다시 넣습니다. 50밀리리터 주사기를 가져다가 주사기와 함께 제공되는 바늘을 부착합니다. 주사기에 20밀리리터의 알파 MEM 배지를 채우고 바늘을 1밀리리터 주사기와 함께 제공되는 바늘로 교체합니다. 멸균 후드에서 가위를 사용하여 분리된 대퇴골 또는 경골의 양쪽 끝을 잘라냅니다. 이제 절단 가장자리의 뼈에 바늘을 삽입하고 골수를 완전한 알파 MEM 배지가 들어 있는 100mm 세포 배양 접시에 세척합니다. 뼈가 눈에 띄게 창백해질 때까지 계속 씻어내면 골수 추출이 성공했음을 나타냅니다. 1밀리리터 피펫 팁을 사용하여 세포 응집체를 분산시키기 위해 위아래로 40회 피펫팅합니다. 이제 40마이크로미터 세포 스트레이너를 통해 세포 현탁액을 50밀리리터 원심분리기 튜브로 여과하여 파편, 조직 조각 및 분산되지 않은 덩어리를 제거합니다. 완전한 알파 MEM 배지로 총 부피를 15밀리리터로 조정하고 여과된 세포 현탁액을 100밀리미터 배양 접시로 옮깁니다. 양손으로 접시를 잡고 8자 모양으로 부드럽게 15회 휘돌려 세포가 접시 전체에 고르게 분포되도록 합니다. 마지막으로 배양 접시를 섭씨 37도, 5% 이산화탄소 인큐베이터에 넣고 5일 동안 배양합니다. 이 그림은 초기 추출에서 배양의 세 번째 계대까지의 골수 간질 세포의 형태학적 진행을 보여줍니다. 갓 추출한 골수 세포는 주로 단핵으로 나타났으며 필드 전체에 흩어진 지방 방울이 보였습니다. 배양 5일째가 되자 방추 모양의 세포가 나타나기 시작했고 약 60%에서 80%의 합류에 도달하여 7일째까지 밀도가 계속 증가했습니다. 1계대에서 3계대까지 골수 간질 세포는 방추형 또는 방추형 형태를 유지하고, 서로 연결된 콜로니를 가진 투명한 단층을 형성했으며, 세포질 과립성이나 핵 단편화와 같은 세포사멸의 징후를 보이지 않았습니다. 유세포 분석을 통해 CD29, CD44 및 Sca-1이 골수 간질 세포에서 높게 발현되는 것을 확인했습니다. 내피 및 조혈 계통의 CD31 및 CD45 마커의 발현은 무시할 수 있었습니다. 마커 정량화는 CD31 및 CD45에 비해 CD29, CD44 및 Sca-1의 높은 발현 수준을 추가로 확인했습니다.