Imaging and Quantifying Mitochondrial Morphology in C. elegans during aging (노화 중 예쁜꼬마선충의 미토콘드리아 형태학의 이미징 및 정량화)

이 프로토콜은 여러 조직에 걸친 미토콘드리아 형태의 변화를 이미지화하고 정량화하는 표준화된 접근 방식을 제공합니다. C 엘레강스에서 미토콘드리아 형태는 종종 그 기능과 관련이 있습니다. 미토콘드리아 형태의 변화는 다양한 질병 상태와 노화의 진행에 따라 관찰 될 수 있으며, 이는 종종 미토콘드리아 기능, 다른 조직 및 우아함의 조절 장애와 관련이 있습니다.

뚜렷한 이미징 전략이 필요한 고유한 미토콘드리아 구조를 나타냅니다. 따라서 적절한 현미경을 선택하고 시료 준비를 최적화하는 것은 미토콘드리아와 C Elegance의 성공적인 조직 특이적 이미징을 위해 필수적입니다. 여기서 우리는 기존의 미토콘드리아 염료 대신 미토콘드리아에 국한된 GFP를 발현하는 형질전환 셀레 균주를 사용하기로 선택했습니다.

이를 통해 표적을 벗어난 효과, 오날 이중 침투 및 염료를 사용하여 다른 조직에서 미토콘드리아를 시각화하는 데 필요한 복잡한 샘플 준비 단계를 피할 수 있습니다. 저희 연구실의 주요 초점은 스트레스와 노화 중 미토콘드리아 항상성을 연구하는 것입니다. 미토콘드리아 이미징 프로토콜의 표준화는 정신적 외 오류를 최소화하고 다양한 생물학적 조건에서 미토콘드리아 형태의 변화에 대한 재현 가능한 결과를 생성하는 데 필수적입니다.

시작하려면 깨끗한 유리 슬라이드를 구하십시오. 샘플 준비를 위해 10-20마이크로리터의 M nine 용액을 유리 슬라이드에 넣고 용액에 특정 연령의 원하는 수의 성충을 놓습니다. 슬라이드에서 M nine 용액의 벌레를 커버 유리로 덮어 근육을 이미지화합니다.

미토콘드리아, 커버 슬립을 살짝 밀어 벌레를 굴립니다. 그런 다음 매니큐어로 커버 유리의 측면을 밀봉하여 M nine 용액의 증발을 방지합니다. 표준 광시야 현미경을 사용하여 형광 태그를 발현하는 근육과 표피 미토콘드리아를 이미지화합니다.

장 미토콘드리아를 이미징하기 위해 컨포칼 현미경을 사용하고 특정 실험 설정에 맞게 이미징 설정을 최적화합니다. 분석을 시작하려면 설치 후 Fiji 응용 프로그램을 열어 mito mapper 매크로를 다운로드하고 설치하십시오. 먼저 소스 코드를 다운로드합니다.

MIT 매퍼 1.0에 대한 IJM 코드 아래에 나열된 코드를 복사합니다. 피지를 열고 플러그인으로 이동한 다음 새 코드 및 매크로를 사용하여 복사한 코드를 매크로 창에 붙여넣습니다. 그런 다음 파일을 통해 나중에 사용할 수 있도록 매크로를 저장하고 다른 이름으로 저장하십시오.

파일로 이동한 다음 Zs.In Fiji로 3D 현미경 이미지를 열고 이미지 아래에 최대 투영을 만든 다음 스택 및 Z 프로젝트를 만듭니다. 최대 투영을 위해 초점이 맞는 이미지 내의 슬라이스 범위를 선택하고 투영 유형으로 최대 강도를 선택하여 최대 투영된 이미지를 저장합니다. tiff는 파일로 이동하여 tiff를 클릭한 다음 저장을 클릭합니다.

사각형 도구를 사용하여 전체 이미지에서 관심 영역을 자르고 이미지로 이동하여 자를 수 있습니다. 파일로 이동한 다음 다른 이름으로 저장 및 tiff를 선택하여 자르기 이미지를 Tiff 형식으로 저장합니다. 이전에 저장한 mito 맵 또는 매크로 파일을 Fiji 도구 모음으로 끌어다 놓습니다.

실행을 클릭합니다. 메시지가 표시되면 이전 단계에서 저장한 TIFF 파일이 포함된 폴더를 선택합니다. 영역을 선택하라는 메시지가 표시되면 사각형 도구를 사용하여 이미지에 사각형을 만들고 확인을 눌러 확인합니다.

마지막으로 파일로 이동하여 미토콘드리아 형태와 관련된 모든 값과 함께 데이터를 도트 CSV 파일로 저장합니다. 미토콘드리아 형태학은 장에서 거미줄과 같은 구조를 상호 연결한 근육의 근육 섬유와 정렬하는 관형 미토콘드리아와 더 둥글거나 타원형의 조직 특이적이었습니다. 컨포칼 현미경을 사용한 피하 이미징의 미토콘드리아는 복합 현미경에 비해 초점이 맞지 않는 빛을 줄여 장 미토콘드리아의 시각화를 개선했습니다.

슬라이드에서 미토콘드리아는 M nine 버퍼에서 30분 후 단편화를 보였으며 표피 미토콘드리아는 가장 두드러진 단편화를 보였습니다. 노화는 모든 조직에서 미토콘드리아 단편화를 초래하여 절단된 구형 구조로 나타났습니다. MIT 매퍼 정량화는 근육에서 물체 길이가 변하고 피하주피에서 접합점이 변하는 것을 나타냈습니다.