Name: Imaging and Quantifying Mitochondrial Morphology in C. elegans during aging (노화 중 예쁜꼬마선충의 미토콘드리아 형태학의 이미징 및 정량화) (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-01-17T14:10:00.000+00:00
Duration: 5 min 29 s
Description: 배우세요 C. elegans의 다양한 조직에서 노화 과정 동안 미토콘드리아 형태를 형광 이미징과 정량 분석으로 평가하는 방법을. 이 프로토콜은 미토콘드리아 기능과 노화 연구에 필수적인 표준화된 접근법을 제공합니다.

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<meta charset="utf8"></head><body>예쁜꼬마선충(C. elegans)의 미토콘드리아 형태학 분석

<table><tbody><tr><td>5-플루오로-2'-데옥시우리딘(FUDR)</td><td>스펙트럼 화학</td><td>F2026-10GMBL</td><td>증식 억제</td></tr><tr><td>APEX IPTG</td><td>RNAi Bacto</td>Agar용 <td>Genesee</td><td>18-242</td></tr><tr><td></td><td>NGM 플레이트용</td><td>VWR</td><td>90000-764</td></tr><tr><td>NGM 플레이트용</td><td>Bacto Peptone</td><td>VWR</td><td>97064-330</td></tr> 염화<tr><td>칼슘 이수화물</td><td>VWR</td><td>97061-904</td><td>NGM 플레이트용</td></tr><tr><td>RNAi</td>콜레스테롤에 대한 <td>Carbenicillin</td><td>VWR</td><td>76345-522</td></tr><tr><td></td><td>VWR</td><td>80057-932</td><td>NGM 플레이트에 대한</td></tr><tr><td>컨포칼 현미경&nbsp;</td><td>Stellaris 5</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>VWR</td><td>BDH1115-1LP</td><td>약물용 솔벤트</td></tr><tr><td>HistoBond 현미경 슬라이드</td><td>VWR</td><td>16005-110</td><td>슬라이드 준비</td></tr><tr><td>LB Broth</td><td>VWR</td><td>95020-778</td><td>LB</td></tr><tr><td>LEICA S7E 해부 스코프</td><td>Leica</td><td>10450840</td><td>표준 해부 현미경</td></tr><tr><td>LEICA STELLARIS 5</td><td>Leica</td><td>158101100</td><td>컨포칼 현미경</td></tr><tr><td>LEICA THUNDER</td><td>Leica</td><td>11525679</td><td>복합 현미경</td></tr><tr><td>마그네슘 황산 헵타하이드레이트</td><td>VWR</td><td>97062-132</td><td>NGM 플레이트, M9</td></tr><tr><td>pL4440 빈 벡터 플라스미드</td><td>addgene</td><td>플라스미드 #1654</td><td>빈 벡터 플라스미드</td></tr> 염화<tr><td>칼</td>륨 <td>VWR</td><td>97061-566</td><td>표백제 soluton</td></tr><tr><td>칼륨 인산염 이염 기</td><td>성 VWR</td><td>EM-PX1570-2</td><td>NGM 플레이트 용</td></tr><tr>인산칼륨<td>인산염 일염기</td><td>성 VWR</td><td>EM-PX1565-5</td><td>M9 용</td></tr><tr><td>아지드 나트륨</td><td>VWR</td><td>97064-646</td><td>마비 웜 염화</td></tr><tr><td>나트륨</td><td>VWR</td><td>EM-SX0420-5</td><td>NGM 플레이트 용, M9</td></tr><tr><td>차아 염소산 나트륨</td><td>VWR</td><td>RC7495.7-32</td> 표<td>백제 용액</td></tr><tr><td>인산나트륨 이염기성</td><td>VWR</td><td>71003-472</td><td>for M9</td></tr><tr><td>Tetracycline hydrochloride</td><td>VWR</td><td>97061-638</td><td>for RNAi</td></tr><tr><td>WOB-L&not; &AE리그; 건식 진공 펌프, 표준, Welch&not; &AE리그;</td><td>포부용</td> <td>VWR</td><td>80077-612</td></tr></tbody></table>

imaging and quantifying mitochondrial morphology in c. elegans during aging (노화 중 예쁜꼬마선충의 미토콘드리아 형태학의 이미징 및 정량화)

Imaging and Quantifying Mitochondrial Morphology in C. elegans During Aging

예쁜꼬마선충(C. elegans )은 투명한 몸체로 인해 미토콘드리아 이미징을 위한 훌륭한 모델로, 과도한 샘플 준비 없이 살아있는 동물을 쉽게 이미징할 수 있습니다. 또한 미토콘드리아 표적 형광 단백질을 발현하기 위해 조직 특이적 프로모터를 사용하여 다른 조직의 미토콘드리아 형태를 쉽게 시각화할 수 있습니다. 여기에서는 myo-3p (근육 미토콘드리아), vha-6p (장 미토콘드리아) 및 col-19p (피하 미토콘드리아)를 사용하여 미토콘드리아 표적 GFP(ATP-1 단백질의 미토콘드리아 국소화 서열)의 발현을 유도했습니다. 예쁜꼬마선충(C. elegans )의 체벽 근육의 미토콘드리아는 근육 섬유(근섬유)를 따라 정렬되는 세뇨관 형태를 나타냅니다(그림 1A). 장 미토콘드리아는 고도로 상호 연결된 거미줄과 같은 구조를 보였으며 정렬이 덜 균일했습니다(그림 1B). 그리고 피하부에는 장이나 근육에 비해 더 둥글거나 타원형으로 보이는 세뇨관 모양의 미토콘드리아가 있습니다(그림 1C). 미토콘드리아 형태는 일반적으로 근육과 장에 있는 기생충의 길이에 걸쳐 일관되지만, 하피는 기생충의 근위부와 원위부 말단 사이의 미토콘드리아의 상호 연결성에 약간의 차이를 보입니다. 따라서 재현 가능한 실험 결과를 얻으려면 신체의 특정 부위에 집중하는 것이 좋습니다. 여기에서 인두와 외음부 사이의 영역(인두 아래 ~100-200 μm)이 일관되게 이미지화됩니다.
근육 및 피하 미토콘드리아의 경우 복합 현미경으로 이미징하면 세포의 평탄도와 초점이 맞지 않는 빛의 수준이 낮기 때문에 충분한 해상도를 얻을 수 있습니다. 그러나 장 미토콘드리아는 장의 다른 부분에서 오는 많은 양의 초점이 맞지 않는 빛으로 인해 해상도가 제한되기 때문에 복합 현미경으로 관찰하기 어렵습니다(그림 2). 따라서 컨포칼 현미경으로 장 미토콘드리아를 이미지화하여 초점이 맞지 않는 빛을 줄이고 적절한 미토콘드리아 형태를 시각화하는 것이 좋습니다.
미토콘드리아의 모양은 매우 역동적이며 동물의 대사 환경에 따라변화합니다 23 또는 다양한 기질 강성24에 대한 노출로 인해 변화합니다. 따라서 먹이 공급원이 없는 상태에서 뻣뻣한 유리 기판 위에 동물을 장기간 현미경 슬라이드에 방치하면 미토콘드리아 형태에 잠재적으로 영향을 미칠 수 있습니다. 여기에서 이 연구는 M9 용액의 슬라이드에서 약 30분 후에 벌레의 미토콘드리아가 단편화되며, 피하 미토콘드리아가 가장 단편화를 보인다는 것을 발견했습니다(그림 3). 따라서 미토콘드리아의 이미징은 샘플 전처리 후 신속하게 수행되어야 합니다.
아지드화나트륨(sodium azide) 및 테트라미솔(tetramisole)을 포함하여 기생충의 이동성을 제한하는 화학 물질은 3D 이미징을 위해 동물의 여러 z-절편을 캡처하기 위해 고정된 기생충이 필요하기 때문에 예쁜꼬마선충의 라이브 이미징에 일반적으로 사용됩니다. 이전 연구에서는 아지드화나트륨 또는 테트라미솔에 노출되면 미토콘드리아 단편화가 발생할 수 있다고 밝혔다25. 놀랍게도, 아지드화나트륨은 높은 농도에서도 근육이나 장의 미토콘드리아 형태에 제한된 영향을 미친다는 것이 밝혀졌습니다. 그러나 피하부는 M9 대조군보다 더 일찍 미토콘드리아 단편화를 보였습니다(그림 3). 중요한 것은 고농도의 테트라미솔(100mM)이 모든 세포 유형에서 노출 직후 상당한 미토콘드리아 단편화를 초래했다는 것입니다. 이에 비해 중간 농도(10mM)는 M9 대조군에 비해 단편화가 더 빨랐습니다. 낮은 농도(1mM)는 미토콘드리아 형태에 제한된 영향을 미쳤습니다. 이러한 데이터는 아지드화나트륨의 활용이 미토콘드리아의 신속한 이미징을 위한 실행 가능한 옵션이 될 수 있는 반면, 테트라미솔은 일반적으로 피해야 함을 시사합니다.
예상대로, 예쁜꼬마선충 의 모든 조직의 미토콘드리아는 자연적인 노화 과정에서 단편화를 보입니다(그림 4A). 단편화는 미토콘드리아로 시각화할 수 있으며, 이는 어린 동물에서 나타나는 선형의 관 모양의 미토콘드리아와 크게 다른 절단된 구형 구조로 나타납니다. 장은 나중에 구형 자가형광 구조에서 증가하므로 자가형광을 실제 미토콘드리아 구조와 혼동하지 않도록 주의해야 합니다. 웜에 따라 미토콘드리아 구조의 변화는 가변적일 수 있기 때문에 몇 마리의 웜을 이미징하는 것보다 상당한 샘플 크기에 대해 미토콘드리아 형태의 정량화를 수행하는 것이 중요합니다. 여기서는 물체, 네트워크, 네트워크당 접합부, 접합점, 물체 길이, 미토콘드리아 발자국, 미토콘드리아 범위 및 물체 면적을 포함한 다양한 메트릭 세트를 사용하여 미토콘드리아 형태를 자동으로 정량화할 수 있는 mitoMAPR이 사용되었습니다(보충 표 1 및 보충 표 2). 자동화는 사용자의 주관적인 편견을 제거합니다. 여기에서는 물체 길이 메트릭이 노화 중 근육 및 장 미토콘드리아 형태의 변화를 정량적으로 측정하는 데 최적이며, 접합점 메트릭은 노화 중 피하 미토콘드리아 형태의 변화를 측정하는 데 최적이라고 보고합니다(그림 4B).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67610/67610fig01.jpg"> 
그림 1: 예쁜꼬마선충(C. elegans)의 전신에 걸친 미토콘드리아의 이미지. 미토콘드리아 영상은 근육(A), 장(B) 및 피하(C)에서 MLS::GFP 발현이 있는 형질전환 동물의 L1 단계에서 EV로 성장한 5일차 전체 기간에 걸쳐 수행되었습니다. 기준자: 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67610/67610fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67610/67610fig02.jpg"> 
그림 2: 복합 현미경과 컨포칼 현미경 간의 미토콘드리아 이미징 비교. 미토콘드리아 영상은 근육(A), 장(B) 및 하피(C)에서 MLS::GFP 발현이 있는 형질전환 동물의 L1 단계에서 EV에서 성장한 1일차 성체 동물에서 수행되었습니다. 눈금 막대 : 5μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67610/67610fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67610/67610fig03.jpg"> 
그림 3: M9, 아지드화나트륨 및 테트라미솔 처리 후 다양한 조직의 미토콘드리아 단편화 평가. 미토콘드리아 영상은 근육, 장 및 피하주에서 MLS::GFP가 발현된 1일차 성체 동물에서 수행되었습니다. 동물은 L1 단계부터 EV에서 성장했습니다. 동물을 M9, 아지드화나트륨(1mM, 10mM 및 100mM) 또는 테트라미솔(1mM, 10mM 및 100mM)을 함유한 슬라이드에 놓고 슬라이드 준비(0분) 직후 또는 슬라이드 준비 후 15분 또는 30분 후에 이미징을 수행했습니다. 2개의 생물학적 복제물에 대해 균주당 n &gt; 5마리의 동물에 대한 대표 이미지가 표시됩니다. 눈금 막대 : 5μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67610/67610fig03large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67610/67610fig04.jpg"> 
그림 4: 다양한 조직에서 노화 중 예쁜꼬마선충 의 미토콘드리아 이미징 및 MitoMAPR을 사용한 미토콘드리아 형태 정량화. (A) 미토콘드리아 영상은 성체의 1, 5, 9, 13, 15일에 성체 동물에서 근육, 장 및 피하주피에서 MLS::GFP의 발현과 함께 수행되었습니다. 동물은 L1 단계에서 EV에서 성장했고 1일차 성체 단계에서 FUDR을 포함하는 EV 플레이트로 이동했습니다. 이미지는 ≥ 3개의 생물학적 복제물에 대해 균주당 n≥ 5마리의 동물을 나타냅니다. 눈금 막대 : 5μm. (B) 1일, 5일, 9일, 13일, 15일에 기생충의 근육 미토콘드리아와 장 미토콘드리아의 물체 길이에 대한 정량화와 1일, 5일, 9일, 13일, 15일에 기생충의 피하 미토콘드리아의 접합점에 대한 정량화. 모든 개별 데이터 포인트는 평균 ± SD와 결합되었습니다. 그래프는 학생 t-test를 사용하여 플롯되고 통계적으로 분석되었습니다. ns = 유의하지 않음, *p &lt; 0.03; **p &lt; 0.002; p &lt; 0.0002; 피 &lt; 0.0001. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67610/67610fig04large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>벌레의 날</td>
			<td>웜의 수</td>
			<td>완충액의 부피 (mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1</td>
			<td>25</td>
			<td>13</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5</td>
			<td>25</td>
			<td>14</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>9</td>
			<td>20</td>
			<td>15</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>13</td>
			<td>20</td>
			<td>15</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
표 1: 슬라이드를 준비할 때 권장되는 웜 수와 버퍼의 양.
보충 그림 1: MitoMAPR을 사용한 단일 이미지 정량화 응용 프로그램 및 여러 이미지에 대한 일괄 처리. (A) MitoMAPR 매크로를 사용하여 단일 이미지에서 미토콘드리아 형태를 정량화하는 워크플로우. (B) 피지를 사용한 원시 3D 이미지 파일의 Z 투영(최대 투영). (C) Z 투영된 이미지에서 관심 영역을 자르는 단계. (D) MitoMAPR 매크로에서 획득한 골격 이미지. 눈금 막대 : 5μm. (E) MitoMAPR 매크로를 사용한 배치 프로세스를 사용하여 여러 이미지에서 미토콘드리아 형태를 정량화하는 워크플로우. (F) 자르기 매크로의 스크린샷. (G) Z 프로젝션을 위한 배치 프로세스의 스크린샷. (H) 일괄 자르기 매크로의 선택 확인 창 스크린샷. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67610/Supplementary%20Figure%201.zip" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 표 1: 예쁜꼬마선충 근육 조직의 미토콘드리아 형태 메트릭에 대한 정량 분석. 기록된 메트릭에는 개체, 네트워크, 네트워크당 접합 수, 연결 지점, 개체 길이, 미토콘드리아 발자국, 개체 면적 및 미토콘드리아 범위가 포함되며, 이는 여러 날에 걸쳐 측정됩니다. 데이터는 노화에 따른 미토콘드리아 형태의 변화를 평가하기 위한 기초를 제공합니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67610/67610_Supplementary%20Table%201.zip" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 표 2: 예쁜꼬마선충의 미토콘드리아 형태에 대한 고정화 화학물질의 효과. 데이터에는 M9 완충액 또는 다양한 농도의 테트라미솔 및 아지드화나트륨으로 시료를 준비한 후 다양한 농도 및 시점에 걸쳐 물체, 네트워크, 네트워크당 접합부, 접합점, 물체 길이, 미토콘드리아 발자국, 물체 면적 및 미토콘드리아 범위와 같은 측정이 포함됩니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67610/67610_Supplementary%20Table%202.zip" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>

Imaging and Quantifying Mitochondrial Morphology in C. elegans during aging (노화 중 예쁜꼬마선충의 미토콘드리아 형태학의 이미징 및 정량화)

Mitochondria, important cellular organelles found in most eukaryotic cells, are major sites of energy production through aerobic respiration. Beyond this ...

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

골격 근육은 운동을 위해 필수적이며, 몸의 주요 단백질 저장소입니다. C. elegans의 내 근육 건강 측정이 설명되어 있습니다. 근육의 구조와 기능에 대한 전향 적 변화는 지역화 된 GFP 및 양이온 성 염료를 사용하여 평가됩니다.

방법은 근육의 세포 내 구획을 평가하기 위해 C. 엘레

이 연구는 자유롭게 사용할 수있는 이미지 처리 도구를 사용하여 C. elegans에서 시냅스 크기와 현지화, 근육 형태 및 미토콘드리아 모양의 정량적 측정을 설명합니다. 이 접근은 C. elegans에 있는 미래 연구 결과가 유전 돌연변이 결과로 조직과 세포기관 구조 변경의 넓이를 정량적으로 비교하는 것을 허용합니다.

예쁜꼬마선충의 세포구조와 세포세포형태를 연구하기 위한 정량적 접근법

전자 현미경, 유전자 센서 및 면역형광을 통해 미토파지를 탐색하려면 값비싼 장비, 숙련된 인력 및 상당한 시간 투자가 필요합니다. 여기에서 우리는 Caenorhabditis elegans 와 간암 세포주 모두에서 미토파지 과정을 정량화하는 상용 형광 염료 키트의 효능을 입증합니다.

세포 기관 특이적 염료를 사용한 Caenorhabditis elegans 및 포유류 세포에서 Mitophagy 검출

미토콘드리아 염료 표지 말단 미토콘드리아의 국소 주입 시 생 체 내 공초점 현미경 검사. 이 방법은 건강한 근육을 가진 쥐와 병든 쥐의 골격근 조직에서 입증된 개념 증명을 활용하여 고해상도 미토콘드리아 시각화를 제공합니다.

마우스의 근육 및 말단 슈반 세포에서 미토콘드리아 형태의 현장 정량화 방법

이미징 C. 엘레간스</emEpifluorescent 현미경과 오픈 소스 소프트웨어를 사용> 태아

우리의 단백질 표현 및 현지화의 postembryonic 규제를 식별할 수 sensitized 방법을...

에 Postembryonic Phenotypes을 식별하기 위해 RNAi 심사 C. elegans</em

기본<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; 방법 : 동기화 및 전망

정량의 화학 주성 반응을 평가하는...

C. elegans의 주 화성 분석

여기에서는 예쁜꼬마선충의 발달 과정을 추적하고 정량화하는 방법을 보여줍니다. 제시된 방법은 쉽게 구현할 수 있는 오픈 소스 도구를 기반으로 합니다. 3D 세포 모양 모델을 재구성하는 방법, 세포 내 구조를 수동으로 추적하는 방법, 피질 수축 흐름을 분석하는 방법을 보여줍니다.

의 발달 프로세스 추적 및 정량화<em&gt; C. 엘레</em&gt; 오픈 소스 도구를 사용하여

여기에 제시 된 방법의 목표는 단백질 집계 모델 유기 체 C. 선 충에서 정상적인 노화 과정을 탐구. 프로토콜 나이 형성 하는 매우 불용 성 큰 집계를 공부 하 고 proteostasis에 변화 단백질 집계에 미치는 영향을 결정 하는 강력한 도구를 나타냅니다.

꼬마 선 충 나이 연구 변화 내재 단백질 집계에 방법

배우세요 C. elegans의 다양한 조직에서 노화 과정 동안 미토콘드리아 형태를 형광 이미징과 정량 분석으로 평가하는 방법을. 이 프로토콜은 미토콘드리아 기능과 노화 연구에 필수적인 표준화된 접근법을 제공합니다.

Imaging and Quantifying Mitochondrial Morphology in C. elegans during aging (노화 중 예쁜꼬마선충의 미토콘드리아 형태학의 이미징 및 정량화)

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