Time-Lapse Epifluorescence Microscopy Imaging of Pseudomonas aeruginosa 및 Staphylococcus aureus 이종 표현형

저희 연구실의 연구는 항생제가 실패하는 이유에 초점을 맞추고 있습니다. 특히, 우리는 항생제에 의해 죽을 것으로 추정되지만 항생제 치료에서 살아남을 수 있는 박테리아 집단 중 지속개체(persister)라고 불리는 소수의 세포에 관심이 있습니다. 그리고 이러한 지속인자는 항생제 치료가 끝난 후 감염이 재발하도록 하는 것으로 생각됩니다.

그래서 우리는 그들의 생존 전략을 더 잘 이해하기 위해 이 생존자들의 유전자 발현과 신진대사를 살펴보는 데 관심이 있습니다. persister 필드의 현재 과제는 단일 셀 민감도와 처리량의 균형을 맞추는 것입니다. 우리는 치료 후 단일 세포의 분열 능력을 일치시켜야 하며, 이를 통해 세포의 내부 작용을 이해하는 데 도움이 될 수 있는 측정 가능한 표현형을 가질 수 있습니다.

그리고 단 하나의 지속인자를 포착하기 위해 수천 개의 세포에 대해 이 작업을 수행해야 할 수도 있습니다. 당사의 프로토콜은 기술적으로 까다로울 수 있는 부정확한 한천 샌드위치 방법이나 미세유체 장치 제조에 비해 쉽게 구현할 수 있도록 개발되었습니다. 우리는 우리의 프로토콜이 최소한의 재료로 시간이 지남에 따라 재현 가능하고 안정적인 이미징을 생성한다는 것을 발견했으며, 이는 고품질 데이터 수집을 위해 비용 효율적이고 낭비를 최소화한다는 것을 의미합니다.

우리의 향후 연구는 오믹스와 단세포 접근법의 조합을 사용하여 병원체가 다양한 종류의 항생제 치료에 어떻게 반응하고 회복하는지 연구할 것입니다. 우리의 궁극적인 목표는 이러한 이해를 활용하여 임상 감염 치료를 개선하기 위한 새로운 전략을 개발하는 것입니다. 시작하려면 멸균 30mm 커버 슬립을 교체 가능한 커버 슬립 접시의 스테인리스 스틸 베이스 바닥에 놓습니다.

폴리카보네이트 인서트를 베이스에 부드럽게 끼우고 커버 슬립이 챔버 바닥을 형성하도록 하고 부착된 실리콘 O-링을 압축하여 제자리에 밀봉합니다. 30mm 커버 슬립에 맞춤형 3D 프린팅 칸막이를 배치하여 모달 셀의 교차 오염을 방지합니다. 선택한 매체를 사용하여 1.5ml 원뿔형 튜브에 50% 아가로스를 준비하고 부드럽게 휘젓습니다.

원뿔형 튜브의 캡을 풀고 유리 비커 또는 전자레인지 사용 홀더에 넣습니다. 아가로스 혼합물을 전자레인지에 돌려 센 불에서 3-4초마다 멈추고 소용돌이치며 섞어 거품이 생기는 것을 방지합니다. 1분 후 혼합물에 녹지 않은 아가로스가 남아 있는지 확인합니다.

균일하게 맑으면 아가로스를 섭씨 60도 정도로 잠시 식힙니다. 관련 항생제 또는 다이를 추가하고 부드럽게 소용돌이쳐 섞이면서 거품이 생기지 않도록 합니다. 2 밀리리터의 아가로 로즈를 30mm 커버 슬립으로 챔버에 피펫팅합니다.

상단 챔버 개구부의 아가로스 위에 멸균 25mm 커버 슬립을 부드럽게 놓습니다. 패드가 1-2시간 동안 굳어지도록 합니다. 패드가 응고되면 미세한 팁 영구 마커를 사용하여 각 샘플의 위치와 신원을 표시합니다.amp25mm 커버 슬립에 있습니다.

스테인리스 스틸 베이스 링이 위쪽을 향하도록 챔버를 뒤집고 베이스의 나사산을 풀면서 아래에 있는 폴리카보네이트 인서트를 조심스럽게 잡습니다. 스테인리스 스틸 베이스를 따로 보관하십시오. 30mm 덮개를 밀어 아가로스 패드에서 미끄러져 버리십시오.

PBS에서 Pseudomonas aeruginosa 또는 Staphylococcus aureus 세포 배양을 단일 세포를 시각화하는 데 적합한 희소 밀도로 희석합니다. 세포를 고르게 분포시키기 위해 피펫을 위아래로 격렬하게 움직입니다. 아가로스 패드의 표시된 위치에서 5마이크로리터의 희석된 세포 현탁액을 찾아냅니다.

얼룩이 건조되면 패드 위에 새 멸균 30mm 커버 슬립을 놓습니다. 그런 다음 한 손으로 폴리카보네이트 인서트를 잡고 커버 슬립 위에 스테인리스 스틸 베이스를 천천히 다시 끼웁니다. 챔버가 밀봉되면 아가로스가 30mm 커버 슬립의 표면에 닿는지 확인합니다.

핀셋의 뭉툭한 끝을 사용하여 아가로스가 25mm 커버 슬립에 닿을 때까지 30mm 커버 슬립을 부드럽게 누릅니다. 시작하려면 스테이지 상단 인큐베이터와 대형 챔버 인큐베이터 온도를 섭씨 37도로 설정하여 현미경 및 이미징 챔버 환경 제어를 준비합니다. 다음으로 챔버 가습기를 켭니다.

아가로스 패드 제제 1개를 스테이지 상단 인큐베이터에 넣고 챔버를 닫아 평형을 이룹니다. 다차원 획득 중에 위상 채널을 사용하도록 내장 자동 초점 알고리즘을 구성하여 이미지 획득을 위한 MetaMorph 소프트웨어를 준비합니다. Stage 탭에서 각 샘플에 대해 여러 스테이지 위치를 설정하여 셀 밀도가 균일하게 분포된 시야를 대상으로 합니다.

그런 다음 Time-Lapse 탭에서 이미지 획득을 위한 지속 시간과 빈도를 구성합니다. Wavelengths 탭에서 수집을 위해 원하는 채널을 설정하고 샘플의 신호 강도에 따라 노출 시간을 조정합니다. 챔버에서 아가로스 패드가 예열되면 가습 뚜껑을 스테이지 상단 인큐베이터에 놓습니다.

그런 다음 현미경에서 위상차에서 미분 간섭 대비 모드로 전환합니다. 적절한 Kohler 조명을 얻기 위해 콘덴서와 조리개 조리개를 조정하십시오. 조정을 완료한 후 위상차 모드로 다시 전환하십시오.

각 스테이지 위치로 이동하여 초점을 조정하고 스테이지 위치를 새 초점면으로 재설정합니다. Acquire 버튼을 클릭하여 다차원 수집을 시작합니다. 획득 후 이미지를 컴파일하려면 MetaMorph를 열고 Review Multidimensional Data 앱을 사용하여 원하는 채널 또는 파장을 선택하고 각 스테이지 위치에 대한 모든 시점을 포함합니다.

이미지 로드를 클릭하고 각 편집을 해당 채널 이름과 함께 TIFF 파일로 저장합니다. 황색포도상구균 세포의 타임 랩스 이미징을 수행하여 항생제 치료가 진행됨에 따라 프로피듐 요오드화물 염색이 발생했으며, 이는 막 손상을 나타냅니다. 항생제 치료 중 녹농균 영상은 세포가 프로피듐 요오드화물 염색을 동반하여 스페로플라스트 형성, 필라멘트화 및 세포질 응축을 겪는 것을 보여주었습니다.

성공적인 아가로스 패드 준비 및 이미징 조건을 통해 항생제 치료로 회복된 황색포도상구균과 항생제 치료에서 회복된 녹농균을 관찰하여 단일 세포에서 파생된 큰 클러스터를 형성할 수 있었습니다.