Name: Time-Lapse Epifluorescence Microscopy Imaging of Pseudomonas aeruginosa 및 Staphylococcus aureus 이종 표현형 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-02-14T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 44 s
Description: 배우세요 Pseudomonas aeruginosa와 Staphylococcus aureus의 항생제 내성 생존 메커니즘을 시차 형광 현미경으로 분석하는 방법을. 이 프로토콜은 지속세포의 표현형 변이를 시각화하여 감염 재발 원인을 규명합니다.

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<meta charset="utf8"></head><body>Visualizeing Antibiotic Persistence in Bacterial Pathogens(박테리아 병원체의 항생제 지속성 시각화)

<ol><li>Brauner, A., Fridman, O., Gefen, O., Balaban, N. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinguishing+between+resistance%2C+tolerance+and+persistence+to+antibiotic+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Distinguishing between resistance, tolerance and persistence to antibiotic treatment.</a> Nat Rev Microbiol. 14, 320-330 (2016).</li>
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<li>Verstraete, L., Van den Bergh, B., Verstraeten, N., Michiels, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ecology+and+evolution+of+antibiotic+persistence%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Ecology and evolution of antibiotic persistence.</a> Trends Microbiol. 30 (5), 466-479 (2021).</li>
<li>Sett, A., Dubey, V., Bhowmik, S., Pathania, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decoding+bacterial+persistence%3A+Mechanisms+and+strategies+for+effective+eradication%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Decoding bacterial persistence: Mechanisms and strategies for effective eradication.</a> ACS Infect Dis. 10 (8), 2525-2539 (2024).</li>
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<li>Lewis, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Persister+cells%2C+dormancy+and+infectious+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Persister cells, dormancy and infectious disease.</a> Nat Rev Microbiol. 5 (1), 48-56 (2006).</li>
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<li>Van den Bergh, B., Fauvart, M., Michiels, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation%2C+physiology%2C+ecology%2C+evolution+and+clinical+importance+of+bacterial+persisters%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Formation, physiology, ecology, evolution and clinical importance of bacterial persisters.</a> FEMS Microbiol Rev. 41, 219-251 (2017).</li>
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<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Peng, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+BaSiC+tool+for+background+and+shading+correction+of+optical+microscopy+images%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">A BaSiC tool for background and shading correction of optical microscopy images.</a> Nat Commun. 8, 14836(2017).</li>
<li>Ducret, A., Quardokus, E., Brun, Y. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicrobeJ%2C+a+tool+for+high+throughput+bacterial+cell+detection+and+quantitative+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Microbiol%22%5BJournal%5D)">MicrobeJ, a tool for high throughput bacterial cell detection and quantitative analysis.</a> Nat Microbiol. 1 (7), 16077(2016).</li>
<li>Paintdakhi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oufti%3A+an+integrated+software+package+for+high-accuracy%2C+high-throughput+quantitative+microscopy+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Oufti: an integrated software package for high-accuracy, high-throughput quantitative microscopy analysis.</a> Mol Microbiol. 99 (4), 767-777 (2016).</li>
<li>Wang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+growth+of+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Robust growth of Escherichia coli.</a> Curr Biol. 20 (12), 1099-1103 (2010).</li>
<li>Moffitt, J. R., Lee, J. B., Cluzel, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+single-cell+chemostat%3A+an+agarose-based%2C+microfluidic+device+for+high-throughput%2C+single-cell+studies+of+bacteria+and+bacterial+communities%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">The single-cell chemostat: an agarose-based, microfluidic device for high-throughput, single-cell studies of bacteria and bacterial communities.</a> Lab Chip. 12 (8), 1487-1494 (2012).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>BaSiC,</td><td>GitHub</td><td>, https://github.com/marrlab/BaSiC</td><td></td></tr><tr><td>Certified Molecular Biology, Agarose</td><td>Biorad</td><td>1613101</td><td></td></tr>, <tr><td>Fiji-ImageJ</td><td>NIH</td><td>https://imagej.net/software/fiji/downloads</td><td></td></tr><tr><td>교환 가능한 커버 글라스 디쉬</td><td>Bioptechs</td><td>190310-35</td><td>아가로스 패드 준비를 위한 35mm ICD, 30mm(#1.5) 커버슬립 포함</td></tr><tr><td>Lumencor Spectra 7 LED 조명 엔진</td><td>Lumencor</td><td>https://lumencor.com/products/spectra-light-engine</td><td>Spectra 7 LED 조명 엔진</td></tr><tr><td>MetaMorph</td><td>Molecular Devices</td><td>Premier 버전 7.10.5</td><td></td></tr><tr><td>pco.edge 4.2 bi sCMOS 카메라</td><td>Excelitas</td><td>https://www.excelitas.com/product/pcoedge-42-bi-usb-scmos-camera</td><td>sCMOS 카메라</td></tr><tr><td>PeCon 라이브 셀 배양 챔버</td><td>peCon</td><td>https://www.pecon.biz/</td><td></td></tr> <tr><td>Thomas Scientific 원형 커버 유리, #1.5 두께, 25mm, 100</td>팩 <td>Fisher Scientific</td><td>NC1272770</td><td>25mm(#1.5) 커버슬립</td></tr><tr><td>Zeiss Axiovert 200M 현미경</td><td>Zeiss</td><td>https://www.zeiss.com/microscopy/en/products/light-microscopes/widefield-microscopes/axiovert-for-materials.html</td><td>Plan-Apochromat 63x/1.40 Oil Ph3 M27 대물렌즈, Lumencor Spectra 7 LED 조명 엔진 및 pco.edge 4.2 bi sCMOS 카메라(6.5mm 픽셀 크기)가 있는 도립 현미경</td></tr></tbody></table>

time-lapse epifluorescence microscopy imaging of pseudomonas aeruginosa 및 staphylococcus aureus 이종 표현형

Time-Lapse Epifluorescence Microscopy Imaging of Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureus Heterogeneous Phenotypes

녹농균(P. aeruginosa) 및 황색포도상구균(S. aureus)에 리포터 플라스미드(reporter plasmids)를 성공적으로 도입하는 것은 올바른 선택적 항생제의 성장에 의해 나타나며 콜로니 PCR 및/또는 염기서열분석(colony PCR) 및/또는 염기서열분석(sequencing)으로 확인할 수 있습니다. 변형된 균주는 관심 유전자가 유도되는 것으로 알려진 조건에 적용하여 표현형 리포터로 검증되어야 하며, 그 결과로 발생하는 형광은 유세포 분석, 분광 광도법 또는 상피 형광 현미경으로 측정할 수 있습니다(그림 1).
후속 실험에 사용할 항생제 용량을 쉽게 선택할 수 있도록 관심 있는 녹농 균 또는 S. 황색포도상 균 균주에 대한 농도 의존성 항생제 지속요법 분석을 수행합니다. 농도 의존적 분석은 일반적으로 낮은 항생제 농도에서 가파른 초기 경사와 높은 농도에서 고원 또는 덜 가파른 경사를 가진 이위상 곡선을 초래합니다. 그러나 일부 항생제 종 쌍의 경우 뚜렷한 이위상 곡선이 발생하지 않을 수 있습니다. 예를 들어, S. aureus delafloxacin 곡선에 대한 곡선은 분명히 이위상이지만(그림 3A), P. aeruginosa levofloxacin 곡선은 그렇지 않습니다(그림 3B)15. 이 시나리오에서는 MIC의 10배 이상인 농도를 선택합니다(예: 녹 농균의 경우 MIC의 약 15배인 5μg/mL)15. 그러나 15x 레보플록사신 MIC는 녹농균 생존율이 ~0.001%에 불과하기 때문에 항생제가 없는 아가로스 패드에서 회복되는 세포를 이미징할 때 지속생존자를 확인하고자 하는 경우 1μg/mL 레보플록사신 치료를 사용합니다(보충 비디오 6). 그렇지 않으면 여러 지속자를 이미지화하는 데 필요한 시야의 수가 엄청나게 많아집니다.
이미징을 시작할 때 이상적인 샘플과 아가로스 패드 준비는 시야 전체에 걸쳐 평면으로 나타나야 하며, 큰 파편, 주름 또는 기포가 없고, 단일 세포가 고르게 분포되어 있어야 합니다. 잘 분포된 단일 세포를 얻으려면 시료 희석 또는 재현탁의 최적화가 필요할 수 있습니다. S. aureus의 경우, 세포는 작은 클러스터를 형성하는 경향이 있으며 아가로스 패드에 파종하기 전에 철저히 와류화해야 합니다(그림 4 및 그림 5). 녹농균(P. aeruginosa)의 경우, 세포는 현탁액의 끈적한 세포외 기질로 둘러싸인 응집체를 형성할 수 있습니다. 이러한 샘플을 철저히 피펫팅하고 단일 세포 이미징을 위해 응집체를 파괴해야 합니다. 
이미징 실험이 종료된 후 이미지의 성공적인 타임랩스는 실험 전반에 걸쳐 x-y 평면의 드리프트를 최소화하면서 초점이 맞춰지고 안정적으로 조명되며 나타납니다. Supplementary Video 7 은 최적의 이미지 획득을 나타내며, t는 음영 또는 드리프트 보정 전 Supplementary Video 4 의 위상 채널입니다. 응결(과도한 가습 또는 불충분한 샘플 온난화로 인한)으로 인해 상단 25mm 커버슬립에 물방울이 형성되어 빛이 왜곡되고 초점면이 자동 초점 알고리즘의 최대 검색 범위 밖으로 밀려나는 경우 초점 손실이 발생할 수 있습니다(보충 비디오 8). 조명의 변화는 일반적으로 이미징 시 이멀젼 오일이 충분하지 않음을 나타냅니다. 스테이지가 너무 빨리 움직이면 대물렌즈의 오일이 뒤로 끌려갈 수 있으며 이미지를 획득할 때 여전히 따라잡을 수 있습니다. 이는 이동 속도를 늦추도록 획득 컨트롤을 조정하거나 다음 위치로의 이동과 이미지 획득 사이에 일시 중지를 추가하여 완화할 수 있습니다. 주요 샘플 드리프트는 일부는 제자리에 머무르는 동안 시야를 가로질러 줄무늬를 이루는 많은 세포처럼 보일 것입니다(보충 비디오 9). 이것은 일반적으로 실험 후반부에 발생하는데, 이는 아가로스 패드가 불충분한 습도 조절로 인해 탈수되었기 때문입니다. 이 백서에 제시된 아가로스 패드 준비는 샘플 안정성을 용이하게 하도록 설계되었지만, 최적의 이미지 획득을 위해서는 샘플과 주변 환경을 적절하게 가온/가습하는 것이 필요합니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67617/67617fig1.jpg"> 
그림 1: 형광 리포터 균주는 관심 유전자의 발현을 조명합니다. (A) S. aureus 는 프로토콜 1에 따라 관심 유전자에 대한 GFP 전사 리포터로 형질주입되었습니다. 리포터 균주를 항생제로 24시간 동안 처리하고, PBS로 세척한 다음, CA-MHB와 요오드화 프로피듐(1.6μM) 및 클로람페니콜(리포터 플라스미드 유지를 위한 10μg/mL)로 만든 아가로스 패드에 파종하여 회복 중 이미징을 수행했습니다(보충 비디오 1). (B) 녹농균(P. aeruginosa )은 관심 단백질에 대한 mScarlet-linked translational reporter를 함유한 플라스미드로 형질전환시켰다26. 리포터 균주를 항생제로 5시간 동안 처리하고, PBS로 세척한 다음, 회복 중 이미징을 위해 BSM과 Tet(75μg/mL, 리포터 플라스미드 유지용)으로 만든 아가로스 패드에 파종했습니다(보충 비디오 2). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67617/67617fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67617/67617fig2.jpg"> 
그림 2: 박테리오파지의 번식 및 수확. (A) 6개의 플레이트는 S. aureus RN4220의 잔디밭에 있는 6개의 다른 양의 희석된 파지 스톡을 보여줍니다. 빨간색 윤곽선은 투명도가 가장 높은 플레이트(굵은 빨간색 윤곽선, 1 x109 PFU/mL)부터 다음 두 희석액(1 x108 및 1 x 107 PFU/mL)까지 수확할 3개의 플레이트를 나타냅니다. 검은색 화살표는 개별 명판을 가리킵니다. (B) 플레이트에서 파지를 회수하려면 부드러운 한천 층을 긁어내고(왼쪽), 슬러리를 다음 희석 플레이트(가운데)로 옮기고, 세 플레이트의 부드러운 한천을 모두 함께 모은 후 원심분리를 위한 원뿔형 튜브로 결합합니다(오른쪽). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67617/67617fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67617/67617fig3.jpg"> 
그림 3: 대표적인 농도 의존적 지속형 분석법. 농도 의존성 플루오로퀴놀론 지속성은 고정상(A) S. aureus(델라플록사신에 대하여) 및 (B) P. aeruginosa(레보플록사신에 대하여)에서 평가되었습니다. 후속 실험에서는 5μg/mL 델라플록사신(빨간색 원)을 사용했는데, 이는 S. aureus 사멸이 이 농도에서 정체되었기 때문입니다. 최소 1μg/mL의 레보플록사신(빨간색 원)의 투여량은 녹농균에 대한 후속 실험에 사용됩니다. 박테리아 사멸은 녹농균에 대해 정체되지 않지만, 지속적인 하위 집단을 나타내는 이위상 곡선의 덜 가파른 "두 번째 단계"가 여전히 있습니다. 패널 3B는 Hare et al.15의 허가를 받아 조정되었습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67617/67617fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67617/67617fig4.jpg"> 
그림 4: 항생제 치료 중 박테리아 표현형 이미징. 고정상(A) S. aureus 및 (B) P. aeruginosa 세포를 플루오로퀴놀론 항생제가 함유된 아가로스 패드에 파종하고 치료 중에 모니터링했습니다: S. aureus 에 대한 5μg/mL delafloxacin(보충 비디오 3) 및 P. aeruginosa 에 대한 5μg/mL levofloxacin(보충 비디오 4)15. Propidium iodide(PI, 녹농균의 경우 16μM, S. aureus의 경우 1.6μM)를 패드에 첨가하여 죽거나 죽어가는 세포를 표시했습니다. S. aureus 세포는 FQ가 있는 상태에서 대체로 손상되지 않고 살아 있는 반면, 대부분의 녹농 균 세포는 용해되어 죽기 전에 둥근 구형체를 형성하는 것을 포함하여 급격한 형태학적 변화를 겪습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67617/67617fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67617/67617fig5.jpg"> 
그림 5: 회복 중 지속인자 추적. (A) S. aureus 및 (B) P. aeruginosa 집단은 플루오로퀴놀론( S. aureus 의 경우 5μg/mL delafloxacin, 녹농균의 경우 1μg/mL levofloxacin)으로 처리한 후 신선한 배지가 들어 있는 아가로스 패드에 파종하고 치료 후 회복 중에 모니터링했습니다(보충 동영상 5 및 보충 동영상 6). 보이는 perisisters는 각 패널의 처음 두 프레임에 녹색 화살표로 표시되며 항생제 치료 중에도 손상되지 않고 생존 할 수 있습니다. 초기 지연 기간이 지난 후, 지속자는 분열하기 시작했고 새로운 자손(녹색 원으로 표시)을 낳았습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67617/67617fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67617/67617fig6.jpg"> 
그림 6: 현미경 시료 준비. (A) 교체 가능한 커버슬립 접시("챔버")를 사용한 샘플 준비 작업 흐름의 개략도. (B) 분해된 챔버 및 개별 구성 요소의 그림. (C) 완전히 조립된 챔버의 사진. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67617/67617fig6large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 비디오 1: S. aureus persister. 그림 1A의 이미지를 포함하는 비디오 파일. 요컨대, 관심 유전자에 대한 GFP 전사 리포터를 지닌 S. aureus 를 항생제로 24시간 동안 처리하고, PBS로 세척한 다음, 회복 중 이미징을 위해 CA-MHB와 프로피듐 요오드화물(1.6μM) 및 클로람페니콜(10μg/mL)로 만든 아가로스 패드에 파종했습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67617/VideoS1_S-aureus_persister_video.avi" target="_blank">이 비디오를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 비디오 2: 녹농 균 지속성. 그림 1B의 이미지를 포함하는 비디오 파일. 요컨대, 관심 단백질에 대한 mScarlet-linked translational reporter를 지닌 녹농균을 항생제로 5시간 동안 처리하고, PBS로 세척한 다음, 회복 중 이미징을 위해 BSM과 Tet(75μg/mL)로 만든 아가로스 패드에 파종했습니다26. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67617/VideoS2_Paeru-fluorescent-persister.avi" target="_blank">이 비디오를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 영상 3: 항생제 치료 중 황색포도상구균. 화학적으로 규명된 풍부한 배지에서 성장한 S. aureus의 고정상 배양물을 프로피듐 요오드화물(1.6μM) 및 델라플록사신(5μg/mL)이 함유된 배양의 무세포 컨디셔닝 배지로 만든 아가로스 패드에 파종했습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67617/VideoS3_S-aureus_treatment.avi" target="_blank">이 비디오를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 비디오 4: 항생제 치료 중 녹농 균. BSM에서 성장한 녹농균의 고정상(stationary-phase) 배양액을 BSM에서 병렬로 성장한 녹농균(P. aeruginosa) 배양물로부터 무세포 조건화 배지로 만든 아가로스 패드에 파종하였다. 아가로스 패드에는 프로피듐 요오드화물(16μM)과 레보플록사신(5μg/mL)도 함유되어 있습니다. 이 비디오는 Hare et al.15의 허가를 받아 각색되었습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67617/VideoS4_P-aeruginosa_treatment.avi" target="_blank">이 비디오를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 비디오 5: 항생제 투여 후 회복 중 S. aureus. S. aureus는 화학적으로 규명된 풍부한 배지에서 고정상으로 성장했습니다. 고정상 배양물을 시험관에서 5μg/mL 델라플록사신으로 24시간 동안 처리하고, PBS로 세척한 다음, 이미징을 위해 프로피듐 요오드화물(1.6μM)을 함유하는 항생제가 없는 CA-MHB 아가로스 패드에 파종했습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67617/VideoS5_S-aureus_recovery.avi" target="_blank">이 비디오를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 비디오 6: 항생제 후 회복 중 녹농 균. BSM에서 성장한 녹농균의 고정상배양을 시험관에서 1μg/mL 레보플록사신으로 7시간 동안 처리하고, PBS로 세척한 다음, 이미징을 위해 프로피듐 요오드화물(16μM)을 함유하는 무항생제 BSM 아가로스 패드에 파종했습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67617/VideoS6_P-aeruginosa_recovery.avi" target="_blank">이 비디오를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 동영상 7: 최적 이미지 획득의 예. 이 비디오는 최적의 타임랩스 획득의 예로서 이미지 처리 전 보충 비디오 4 의 위상 채널입니다. 실험 전반에 걸쳐 최소한의 드리프트, 안정적인 조명 및 초점 유지에 주목하십시오. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67617/VideoS7_uncorrected-Paeru.avi" target="_blank">이 비디오를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 비디오 8: 응결로 인한 최적이 아닌 이미지 획득의 예. 이 비디오는 샘플의 부적절한 가열 및/또는 이미징 환경의 과도한 가습으로 인한 챔버의 응결로 인해 이미지 획득이 잘못된 초점의 영향을 받은 실험의 일부를 보여줍니다. 이미징되는 샘플은 BSM 아가로스 패드에서 항생제 후 회수 중 레보플록사신으로 처리된 녹농 균이었습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67617/VideoS8_Suboptimal_Imaging_Condensation.avi" target="_blank">이 비디오를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 비디오 9: 드리프트로 인한 최적이 아닌 이미지 획득의 예. 이 비디오는 이미지 획득이 샘플 드리프트의 영향을 받았을 때 실험의 일부를 보여주는데, 이는 탈수 및 커버슬립에서 아가로스 패드의 수축/들림으로 인한 것일 수 있습니다. 이미징된 샘플은 레보플록사신(levofloxacin)과 프로피듐 요오드화물(propidium iodide)을 함유한 아가로스 패드의 녹농균(P. aeruginosa )이었습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67617/VideoS9_Suboptimal_Drift.avi" target="_blank">이 비디오를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 파일 1: 25mm-3D-divider-for-35mmBioptechs.stl <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67617/25mm-3D-divider-for-35mmBioptechs.stl" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>

Time-Lapse Epifluorescence Microscopy Imaging of Pseudomonas aeruginosa 및 Staphylococcus aureus 이종 표현형

Antibiotic persistence is a phenomenon in which a small number of bacterial cells in a genetically susceptible population survive antibiotic treatment ...

time-lapse-epifluorescence-microscopy-imaging-pseudomonas-aeruginosa

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

프로토콜 공촛점 레이저 스캐닝 현미경 (CLSM)에 대한 미생물 biofilms 성장 분석을위한 플로우 전지 시스템의 응용 프로그램을 설명합니다.

흐름 세포 녹농균 및 Saccharomyces cerevisiae의의 Biofilm

이 프로토콜은 자동 형광 시간 경과 현미경을 사용하여 시간에 다른 박테리아의 단일 세포의 행동을 모니터하기위한 단계별 절차를 제공합니다. 또한, 우리는 어떻게 현미경 이미지를 분석하는 지침을 제공합니다.

라이브 셀 이미징 바실러스 subtilis과 연쇄상 구균 pneumoniae 자동 시간 저속 현미경을 사용하여

출처: Chetrit, D. 외 레 지오넬라 폐포균 DOT/ICM 분비계의 시공간적 특징을 해명하기 위해 생세포 영상 및 냉동 전자 단층촬영 적용. J. Vis. 경험 (2020).이 영상은 형광 표지된 병원성 박테리아의 준비와 영상 촬영 과정을 시연합니다. 아가로스 패드는 먼저 접착 프레임 안에 준비되어 위치시킵니다. 형광 단백질을 발현하는 유전자 변형 박테리아의 현탁액을 패드에 적용하여 세포를 고정시킵니다. 프레임은 커버슬립으로 밀봉되어 현미경으로 관찰하여 박테리아의 형광 이미지를 포착합니다.

형광 표지 박테리아의 샘플 준비 및 영상

Source: Jackson, L., et al. Visualization of Pseudomonas aeruginosa within the Sputum of Cystic Fibrosis Patients. J. Vis. Exp. (2020)This video demonstrates the in situ visualization of Pseudomonas aeruginosa within chemically cleared cystic fibrosis sputum using fluorescent labeling and confocal microscopy to reveal bacterial localization and biofilm structure.

Visualization of Pseudomonas aeruginosa in Sputum Samples from Cystic Fibrosis Patients

이 비디오는 녹농균(Pa) 응집체에 대한 항균 처리의 영향을 연구하기 위한 시험관 내 기술을 보여줍니다. 형광 표지된 Pa 세포는 감염 중 성장 패턴을 모방하는 응집체로 성장합니다. 치사량 이하의 항생제 콜리스틴 농도로 응집체에 이의를 제기하면 형광 현미경을 통해 박테리아-항생제 상호 작용에 대한 실시간 평가가 수행됩니다.

박테리아 응집체에 대한 항균 처리를 연구하기 위한 In vitro 기술

우리는에 의해 분비 PSMS 및 기타 독소의 효과를 연구하는 방법을...

의 상호 작용을 연구<em&gt; 황색 포도상 구균</em&gt; 유동 세포 계측법 및 시간 경과 현미경에 의한 호중구와

우리는 고정, 파라핀 포함, 및 미생물 식민지 biofilms 얇은 단면 기술을 설명 합니다. 준비 샘플, biofilm 구조 및 기자 식 패턴 현미경 검사 법에 의해 구상 될 수 있다.

파라핀 포함 및 현미경 분석에 대 한 미생물 식민지 Biofilms의 얇은 단면

이 살아있는 세균성 세포 화상 진찰 프로토콜은 시간이 지남에 따라 단세포 수준에서 다중 세균성 종 사이 상호 작용의 시각화를 허용합니다. 시간 경과 화상 진찰은 개별 세포 운동성 및 생존성을 포함하여 다종 세균성 지역 사회에서 종 간 상호 작용을 심문하기 위하여 단배문화 또는 공동 문화에서 각 세균성 종의 관찰을 허용합니다.

단세포 종 간 세균성 상호 작용의 운동 시각화

합성 낭포성 섬유증 가래 배지(SCFM2)는 공초점 레이저 스캐닝 현미경 검사 및 형광 활성화 세포 분류와 함께 사용하여 고해상도에서 세균 응고체를 관찰할 수 있다. 이 논문은 향후 연구를 위한 플랫폼으로서 항균 치료 중 집계 인구를 평가하는 방법을 자세히 설명합니다.

슈도모나스 아에루기노사 감염 모델의 실시간 평가를 위한 도구

항생제 지속성은 민감한 동종 집단 내의 작은 하위 집단이 고용량의 살균 항생제를 일시적으로 견딜 수 있는 능력을 설명합니다. 현재 프로토콜은 대장균 을 치사량의 오플록사신에 노출시킨 후 분자 및 세포 수준에서 항생제 지속성 표현형을 특성화하기 위한 접근 방식을 결합합니다.

대장균의 항생제 지속성에 대한 개체군 및 단일 세포 분석

배우세요 Pseudomonas aeruginosa와 Staphylococcus aureus의 항생제 내성 생존 메커니즘을 시차 형광 현미경으로 분석하는 방법을. 이 프로토콜은 지속세포의 표현형 변이를 시각화하여 감염 재발 원인을 규명합니다.

Time-Lapse Epifluorescence Microscopy Imaging of Pseudomonas aeruginosa 및 Staphylococcus aureus 이종 표현형

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