절개된 유충 제브라피쉬의 신경근 접합부에서 시냅스 소포 재활용의 라이브 이미징

우리는 애벌레 제브라피쉬의 신경남성 접합을 모델 시스템으로 사용하여 시냅스 전달의 분자 및 세포 메커니즘을 연구합니다. 우리는 다양한 생리학적, 병리학적 조건에 대한 반응으로 시냅스의 조절 조절을 명확히 하는 데 관심이 있습니다. 이 프로토콜을 통해 민감도가 향상된 유충 제브라피시 신경근 접합부에서 활동 전위 유도 새로운 전달을 시각화할 수 있습니다.

우리는 이전에 테스트되지 않은 적당한 자극에 의해 유도되는 시냅스 기능을 모니터링할 수 있습니다. 이 이미징 프로토콜은 기존의 epifluorescence microscope에서 수행할 수 있으며 컨포칼 레이저 스캐닝 현미경이 반드시 필요한 것은 아닙니다. 즉, 이 방법은 다른 실험 설정에 비해 신경근 기능을 이미징하기 위한 비용 효율적인 플랫폼을 제공합니다.

세포 외 용액 200ml를 준비하려면 3.5몰 염화나트륨 6.4ml, 염화몰 1몰 0.4ml, 1몰 HEPES 1ml, 염화몰 칼슘 0.4ml, 염화몰 1몰 0.2ml 및 포도당 360mg을 혼합합니다. 그런 다음 초순수를 추가하여 총 부피를 200ml로 만듭니다. 20마이크로리터의 15밀리몰 D-투보쿠라린 원액을 첨가하여 3마이크로몰의 D-투보쿠라린이 함유된 100밀리리터의 세포외 용액을 준비합니다.

0.02%트리카인을 함유한 세포외 용액 25ml를 준비하려면 용액 25ml에 1%트리카인 원액 0.5ml를 첨가합니다. 마이크로 피펫 풀러를 사용하여 팁 직경이 3-10 마이크로미터 범위 내에서 측정될 때까지 세타 유리 모세관을 당깁니다. 피펫에 세포외 용액을 채웁니다.

모세관의 각 개구부에 얇은 백금 와이어를 삽입하고 theta glass 피펫 전극을 전동 마이크로 매니퓰레이터의 피펫 홀더에 고정합니다. 그런 다음 각 와이어의 백엔드를 자극 아이솔레이터에 연결합니다. 0.02%트리카인이 함유된 세포 외 용액 25ml를 유리 페트리 접시에 넣고 제브라피시 유충을 페트리 접시에 옮겨 해부합니다.

두 개의 가는 집게를 사용하여 유충의 피부를 벗겨냅니다. 첫 번째 집게를 사용하여 유충을 제자리에 고정하고 다른 집게로 부레의 등쪽 피부를 꼬집습니다. 그런 다음 메스를 사용하여 수영 방광, 내부 장기 및 머리를 제거합니다.

파이어폴리싱 처리된 팁이 있는 유리 파스퇴르 피펫을 사용하여 절개된 제브라피시 샘플을 이미징 챔버로 옮깁니다. C자형 백금 와이어에 접착된 나일론 나사산으로 샘플을 기계적으로 고정하여 자극 전극과 거의 평행한 각도로 방향을 지정합니다. 3마이크로몰 D-튜보쿠라린을 함유한 세포 외 용액으로 분당 1ml의 속도로 중력 흐름 시스템을 사용하여 샘플을 관류합니다.

그런 다음 자극 전극을 척수에 삽입합니다. 척수의 복부 쪽에 위치한 TagRFP 양성 뉴런으로 식별되는 척추 운동 뉴런 근처에 전극 팁을 조심스럽게 배치합니다. 전극을 인접한 세그먼트에서 목표 위치로 비스듬한 각도로 전진시킵니다.

컴퓨터에서 시작하려면 TagRFP 형광의 라이브 이미지를 기반으로 이미징 영역을 선택합니다. 선택한 영역에 여러 bouton이 포함되어 있는지 확인하고 body segment 경계 근처에 있는 bouton은 제외합니다. 이미징을 위해 형광 필터 장치 GFP 불소 형광을 전환합니다.

다음으로, 광원의 강도를 조정하여 채도 없이 1헤르츠 타임랩스 모드에서 밝은 이미지를 얻습니다. micromanager 창의 exposure milliseconds 필드에 노출 시간을 100으로 입력합니다. 이미지 획득 소프트웨어와 디지털 입력 출력 장치를 구성하여 이미지 획득을 전기 자극과 동기화합니다.

다음으로, Arduino 스크립트에서 자극 빈도, 활동 전위의 수, 이미지 획득 시작과 자극 전달 사이의 시간 지연을 결정합니다. 이러한 설정을 기반으로 획득에 필요한 총 이미지 수를 계산하고 Micromanager의 다차원 획득 창의 카운트 필드에 이 값을 입력합니다. 1헤르츠 타임랩스 이미징을 위해 간격 필드에 1초 간격을 설정합니다.

전기 자극의 경우, 70밀리볼트의 1밀리초 정전압 펄스를 전달하도록 자극 아이솔레이터를 구성하십시오. 디지타이저 명령을 실행하여 이미지 획득을 시작합니다. 프로세스를 모니터링하여 허용할 수 없는 이미지 드리프트가 없는지, 불소와 반응이 관찰 가능한지 확인합니다.

펄스 수의 주파수와 같은 자극 강도를 수정하거나 실험 목적에 따라 온도를 조정합니다. 타임랩스 이미지를 TIFF 시계열 스택으로 저장합니다. 분석을 위해 신호 증가가 큰 시냅스를 선택하였으나, 모든 boutons는 20 hertz 100 활동 전위 조건에서 감지 가능한 변화를 보였으나, 고주파 전기 자극 시 강력한 불소 반응이 관찰되었으며, 자극 및 후속 붕괴 중 exocytosis를 나타내는 형광 변화와 함께 세포내이입 및 시냅스 소포의 재산성화를 반영하였습니다.

형광 감쇠 시간 상수는 자극, 강도 및 온도에 따라 다양했으며 20 헤르츠 25 활동 전위는 16.6 초, 20 헤르츠 100 활동 전위는 56.8 초, 50 헤르츠 500 활동 전위는 62.7 초에 나타났습니다.