정량적 대사 플럭스 연구를 위한 세척된 인간 혈소판의 준비

저는 급성 에스트로겐 노출이 혈소판, 중추 탄소 대사 및 휴식, 트롬빈 활성화 혈소판에 미치는 영향을 연구했습니다. 우리는 혈소판에 대한 급성 에스트로겐 노출이 경구 피임약 사용으로 인한 혈전성 위험 증가에 기여하는지 확인하려고 시도하고 있습니다. 여성 건강 연구는 대체로 자금이 부족합니다.

이 프로젝트는 여성 건강에 대한 지식의 격차를 해소하기 위한 NIH의 대규모 요청의 일부였습니다. 피임약을 사용할 수 있게 된 지 50년이 넘었지만, 혈전 위험을 높이는 정확한 메커니즘은 여전히 알려져 있지 않습니다. 생물학적 변동성.

전통적인 세포 배양 기술은 혈소판에 적용되지 않으며, 이는 혈소판이 다른 유전자형을 가진 기증자로부터 나온다는 것을 의미합니다. 큰 샘플 크기가 필요하며, 이는 반복 가능한 혈소판 분리 절차의 필요성을 강조합니다. 기존 혈소판 세척 프로토콜은 혈소판 생물학 분야의 전문가를 위해 작성되었습니다.

혈소판 연구와 관련된 여러 가지 고유한 과제가 있으며, 제 프로토콜은 초보 혈소판 연구자를 위해 강조합니다. 시작하려면 수조를 섭씨 37도로 예열하고 포도당이 포함된 수정된 Tyrode의 완충액을 넣습니다. 모든 진공에서 수집한 전혈을 50ml 폴리프로필렌 원뿔형 튜브에 결합합니다.

베벨 컷 피펫 팁을 사용하여 적절한 샘플 부피를 취하여 세포 계수를 수행합니다. 생성된 기포를 제거하기 위해 좁은 구멍 전사 피펫으로 조심스럽게 흡인합니다. 그런 다음 혈액을 섭씨 37도의 수조에 25분 동안 그대로 두십시오.

원심분리 중 활성화를 방지하기 위해 프로스타글란딘 I2와 아피라아제를 전혈에 첨가하고 튜브를 한 번 뒤집어 검체를 혼합합니다. 다음으로 전혈을 250G에서 15분 동안 섭씨 37도에서 쉬지 않고 원심분리합니다. 담황색 털과 붉은 혈액층 위의 맨 위 노란색 층으로 나타나는 PRP를 벽을 따라 기울어진 새로운 50ml 원뿔형 튜브로 수집합니다.

PRP를 섭씨 37도에서 10분 동안 휴지시킵니다. 배양 후 PRP를 500 나노 몰 프로스타글란딘 I2 및 아피라제 밀리리터당 0.02 단위와 혼합합니다. 1, 000G에서 혼합물을 37 °C에서 가속 및 휴식없이 10 분 동안 원심분리하십시오.

이제 플라스틱 광역 전사 피펫을 사용하여 벌크 부피에 대한 상등액을 흡인한 다음 절단되지 않은 팁이 있는 1ml 피펫을 사용하여 펠릿 근처에 남아 있는 액체를 흡인합니다. 그런 다음 프로스타글란딘 I2와 아피라아제를 함유한 Tyrode's buffer를 원뿔형 튜브 옆면의 펠릿에 추가합니다. 베벨 컷 팁과 1ml 피펫 팁을 사용하여 펠릿을 여러 번 부드럽게 다시 매달립니다.

펠릿이 다시 부유되면 광경 전사 피펫을 사용하여 적혈구 또는 눈에 띄게 응집된 세포를 남기고 새 원추형 튜브로 옮깁니다. 그런 다음 베벨 컷 피펫 팁을 사용하여 유세포 분석을 위한 샘플을 채취합니다. 나머지 혈소판을 섭씨 37도에서 1시간 동안 배양하여 억제제가 사라지도록 합니다.

배양 후, 검체를 넓은 구멍의 피펫과 부드럽게 혼합하고 유세포 분석을 위해 검체를 분취합니다. 전혈에서 평균 혈소판 회수율은 약 52%였으며 세척 과정 후 백혈구 오염은 0.1% 미만으로 유지되었습니다. P-셀렉틴 노출은 세척 과정 전반에 걸쳐 낮았으나 트롬빈 처리 후 크게 증가했습니다.

결합된 피브리노겐 수치는 첫 번째 1,000G 스핀 후 처음에는 급증했지만 두 번째 스핀 후에는 5% 미만으로 떨어졌으며 트롬빈 치료 후 다시 크게 증가했습니다. 혈소판은 활성화 마커를 측정하기 전에 크기, 단일체 및 CD42a 양성에 대해 성공적으로 게이트되었습니다. 트롬빈 치료는 대조군에 비해 P-셀렉틴과 피브리노겐 발현을 유의하게 증가시켰다.

먼저 인간 혈액 샘플에서 세척된 혈소판을 얻습니다. 마이크로 원심분리기를 섭씨 0도로 사전 냉각한 후 부분적으로 동결된 생리식염수에 혈소판 현탁액을 1:6 비율로 수집합니다. 16, 0 섭씨 온도에 10 분 동안 000G에 혼합물을 원심 분리하십시오.

상층액을 별도의 마이크로 원심분리기 튜브로 흡입합니다. 다음으로, 영하 20도의 미리 냉각된 메탄올 0.5밀리리터를 담금질된 펠릿에 넣고 1분 동안 격렬하게 소용돌이칩니다. 샘플을 액체 질소로 동결하고 섭씨 0도에서 해동합니다.

16, 섭씨 4도에 10 분 동안 000G에 현탁액을 다시 분리기를 원심분리기하고, 새로운 마이크로 분리기 관에 있는 상등액을 모으십시오. 상층액을 하룻밤 동안 건조시킨 후, 건조 추출물을 LC/MS 등급의 물 150마이크로리터에 재현탁시키고 섭씨 4도에서 15분 동안 혼합합니다. 추출물을 잠시 와류로 가열하고 0.22마이크로미터 마이크로 원심분리기 튜브로 옮겨 세포 파편을 제거합니다.

16, 000G 및 섭씨 4도에서 5분 동안 샘플을 원심분리하십시오. 원심분리 후 필터에 50마이크로리터의 물을 추가로 피펫으로 주입하고 섭씨 16, 000G 및 4도에서 5분 동안 다시 원심분리합니다. 마지막으로 분석을 위해 여과액을 수집합니다.

젖산 생성은 모든 공여자 샘플에서 양성이었으며 포도당과 아세테이트는 지속적으로 섭취되었으며 트롬빈은 이러한 플럭스를 강화했습니다.