2.5D 모델: 생체 조직에서 발아 혈관 형성의 생체 외 기계적 특성화를 위한 모델

3D 생체 조직에서 발아 혈관 형성을 유도하는 세포 역학을 정량화하는 것은 여전히 어렵지만 재생 의학 분야에서 계속 발전하기 위해서는 필요합니다. 이 프로토콜은 2D 정량적 방법의 접근성과 3D 조직의 표현성을 결합하여 작업에 보다 쉽게 접근할 수 있도록 합니다. 살아있는 조직에서 혈관신생이 싹을 틔우는 동안 세포력을 정량화하는 기존 방법은 복잡하고 계산 비용이 많이 드는 3D 힘 추론으로 제한됩니다.

당사의 프로토콜은 X-vivo 시스템용 견인력 현미경을 적용하여 체외 제어와 생체 내 관련성을 연결하며, 공간적 시간적 기계적 힘 특성화를 위한 사용하기 쉬우면서도 생리학적으로 관련된 방법을 제공합니다. 2 Nav-D 모델은 세포 역학에 대한 정량적 분석을 허용하면서 생리학적 맥락을 보존하여 발아 혈관 신생을 유발하는 역학을 연구하기 위한 고유한 접근 방식을 제공합니다. 먼저 120마이크로리터의 실란 용액을 유리 바닥의 12웰 플레이트의 각 웰에 피펫으로 결합합니다.

플레이트를 실온에서 1시간 동안 배양합니다. 배양 후 스프레이 병을 사용하여 절대 에탄올로 우물을 세 번 씻고 질소 가스를 사용하여 플레이트를 건조시킵니다. 갓 준비한 폴리아크릴아미드 또는 PAA 젤 혼합물 11.5마이크로리터를 각 웰의 유리 바닥에 피펫으로 넣습니다.

각 물방울 위에 13mm 커버 슬립을 부드럽게 놓습니다. 중합 후 PBS를 우물에 첨가하십시오. 구부러진 바늘을 사용하여 PAA 젤의 커버 슬립을 부드럽게 풉니다.

그런 다음 핀셋을 사용하여 우물에서 덮개 슬립을 제거합니다. 초순수에 용해된 설파 삼파 1밀리리터당 1밀리그램 75마이크로리터를 PAA 겔에 추가합니다. 플레이트를 365나노미터 자외선 아래에 5분 동안 놓습니다.

PBS로 젤의 설파 삼파를 빠르게 헹굽니다. 그런 다음 기능화된 PAA 젤을 PBS로 각각 10분씩 두 번 세척합니다. 50마이크로리터의 콜라겐 4 용액을 기능화된 PAA 젤에 피펫팅하고 섭씨 4도에서 밤새 배양합니다.

다음 날, PBS로 젤을 두 번 씻고 5분 동안 건조시킵니다. 젤 위에 50마이크로리터의 내피 세포 성장 또는 ECG 배지를 추가합니다. 접시를 섭씨 37도에서 5% 이산화탄소로 1시간 동안 배양합니다.

먼저 멸균 수술용 핀셋을 사용하여 변형된 CREB 용액이 들어 있는 운송 병에서 돼지 경동맥을 멸균 PBS로 채워진 큰 페트리 접시로 옮깁니다. 수술용 핀셋과 메스를 사용하여 경동맥 주변의 과도한 조직을 제거합니다. 동맥 양쪽 끝에서 2-3cm 떨어진 곳을 메스로 잘라 동맥 분기점 근처를 제거합니다.

끝이 둥글고 둥근 핀셋과 메스를 사용하여 경동맥을 둘러싼 동맥 근막을 제거합니다. 핀셋을 사용하여 청소한 경동맥을 PBS로 채워진 새로운 큰 페트리 접시로 옮깁니다. 동맥을 약 2mm 너비의 고리로 자릅니다.

그런 다음 ECG 배지가 들어 있는 예열된 작은 페트리 접시에 링을 옮깁니다. 고리를 섭씨 37도에 놓습니다. 먼저 둥근 끝 핀셋을 사용하여 돼지 경동맥 고리를 ECG 배지에서 PBS로 채워진 중간 크기의 페트리 접시로 옮깁니다.

둥근 끝 핀셋과 메스를 사용하여 고리를 반으로 자른 다음 고리 반을 약 2mm 너비의 시트로 해부하여 2 x 2mm 크기의 동맥 시트를 만듭니다. 둥근 끝 핀셋을 사용하여 동맥 시트를 뒤쪽으로 잡고 내피 내벽이 PAA 기질을 향하도록 PAA 젤 가장자리에 시트를 배치합니다. 다음으로, 핀셋을 사용하여 동맥 시트를 젤을 건드리지 않고 PAA 하이드로겔의 중앙으로 부드럽게 이동합니다.

동맥 시트 위에 50마이크로리터의 ECG 배지를 추가하면서 방울이 겔에 남아 있는지 확인합니다. 끝이 둥근 핀셋을 사용하여 매체의 PAA 기판에 있는 동맥 시트 위에 마른 13mm 커버 슬립을 놓습니다. 유리 바닥의 내부 테두리를 사용하여 중간 방울이 아래로 퍼질 때까지 커버 슬립을 부드럽게 내립니다.

조직이 섭씨 37도, 5% 이산화탄소에서 5시간 동안 부착되도록 합니다. 그런 다음 각 웰에 1ml의 ECG 배지를 추가합니다. PAA 기판의 동맥 시트를 섭씨 37도에서 5% 이산화탄소로 24시간 동안 배양합니다.

다음날 구부러진 바늘을 사용하여 커버 슬립을 조심스럽게 들어 올려 핀셋으로 동맥 시트에서 제거합니다. 조직을 건드리지 않고 진공 흡입을 사용하여 웰 및 주변 조직에서 매체를 제거하고 각 동맥 시트에 콜라겐 유형 1 젤 혼합물 10마이크로리터 방울을 추가합니다. 젤이 섭씨 37도에서 5% 이산화탄소에서 1시간 동안 중합되도록 합니다.

배양 후 각 웰에 예열된 ECG 배지 1ml를 부드럽게 추가합니다. 플레이트를 섭씨 37도, 이산화탄소 5%의 인큐베이터로 24시간 동안 옮깁니다. 13mm의 처리되지 않은 커버 슬립을 사용하여 제거 중 순전한 힘을 최소화했을 때 동맥 시트의 부착 효율 증가가 관찰되었습니다.

2.5D 시스템에서 돼지 경동맥 배양 24시간 후 발아 혈관 신생을 확인합니다. 발아 혈관 신생이 관찰되면 ECG 배지를 새로 고치고 현미경의 섭씨 37도의 예열 배양 상자 내의 스테이지 홀더에 12웰 플레이트를 놓습니다. 이미징 요구 사항에 따라 microscope objective를 선택합니다.

노출 시간을 설정하고 위상차 이미징을 사용하여 초점 평면을 조정합니다. 그런 다음 형광 구슬의 이미징을 위해 형광 채널을 추가하고 노출 시간을 다시 설정합니다. 샘플에서 여러 관심 영역을 선택하고 각 위치에 대한 초점 평면을 조정합니다.

5분에서 20분의 시간 간격과 4에서 24시간의 기간을 선택하여 관심있는 타임랩스를 정의합니다. 초점 시스템을 켜서 타임랩스 이미징 내내 안정적인 초점을 유지합니다. 다음으로 견인력 현미경 검사를 위해 초순수에 5%SDS를 넣고 자라는 세포가 분리될 때까지 몇 분 동안 기다립니다.

선택한 각 위치에 대한 PAA 기판에서 형광 마커의 Z 스택을 획득하여 참조 이미지로 형광 마커의 편안한 상태를 얻습니다. 사용자 지정 MATLAB 코드를 사용하여 이미지 처리를 위한 타임랩스 및 참조 이미지를 선택하고 분석을 위한 파라미터를 정의할 수 있습니다. 정확한 분석을 위해 최상의 참조 이미지를 기준으로 타임랩스 이미지를 정렬하고 자릅니다.

타임랩스 이미지와 참조 이미지 사이의 입자 이미지 속도 비대칭을 수행하여 PAA 하이드로겔에서 형광 마커의 변위를 측정합니다. 이미지 속도 비대칭 분석을 구성하여 이미지를 0.5 중첩이 있는 32 x 32 픽셀의 질문 창으로 나눕니다. 마지막으로, PAA 겔의 기계적 특성을 기반으로 세포 견인력을 계산합니다.

돼지 동맥 시트의 2.5D 및 3D 모델 내에서 세포 새싹의 형성이 관찰되었으며, 이는 혈관 형성 패턴과 유사했지만 2D 모델에서는 발아 혈관 형성이 나타나지 않았습니다. PAA 하이드로겔의 부드러운 기질 강성은 더 단단한 PAA 기질에 비해 조기 동맥 발아 혈관 형성을 촉진하여 매트릭스 강성 효과를 입증했습니다. 견인력 현미경 검사는 세포 새싹이 리더 세포와 추종자 세포에 의해 구동되는 돌기 축에서 끌어당기는 힘과 새싹 축을 따라 미는 힘을 나타낸다는 것을 밝혔습니다.