반복되는 자기 자극 하에서 체외 에서 Myelin 파편의 미세아교세포 형성 평가

[강사] 우리 연구의 범위는 신경 재활 및 자기 시뮬레이션 요법 연구에 중점을 둡니다. 이 프로토콜은 자기 자극이 명확한 기능에 어떤 영향을 미치는지 탐구하는 데 있어 자기 자극에 대한 새로운 아이디어를 제공할 수 있습니다. 앞으로는 신경 재활과 자기 자극 요법에 주력할 것입니다.

[강사] 시작하려면 암컷 쥐의 참수된 머리를 얻으십시오. 얼음 위에서 머리를 해부합니다. 가위로 두개골을 양분하여 뇌를 완전히 노출시키고 완전히 제거하는 것을 용이하게 합니다. 가위와 집게를 사용하여 막, 소뇌 및 해마를 꼼꼼하고 무균적으로 절제합니다. PBS로 뇌를 세 번 세척하여 잔여 혈액이나 조직을 제거합니다. 세척된 뇌를 10밀리리터의 0.32몰 멸균 자당 용액으로 옮깁니다. 미세 수술 가위를 사용하여 뇌 조직을 조각으로 잘라 뇌 조직-자당 혼합물을 얻습니다. 다음으로, 뇌 조직-자당 혼합물을 50밀리리터 멸균 균질화기로 옮깁니다. 0.32몰 멸균 자당 용액 30밀리리터를 첨가합니다. 50밀리리터 유리 균질화기를 사용하여 조직을 2분 동안 분쇄합니다. 매끄러운 뇌 조직 균질을 얻기 위해. 뇌 조직 균질액을 0.32몰 멸균 자당 용액으로 90밀리리터로 희석하고 완전히 혼합합니다. 0.83몰 멸균 자당 용액 20밀리리터를 멸균 벽이 얇은 폴리프로필렌 초원심분리기 튜브 6개에 첨가합니다. 그런 다음 뇌 혼합물 15밀리리터를 튜브 상부에 천천히 분배합니다. 0.32몰 멸균 자당 용액으로 부피의 수평을 맞춥니다. 조잡한 미엘린 파편을 수집하려면 먼저 섭씨 4도에서 초원심분리기 로터를 예냉합니다. 샘플을 75,000G에서 45분 동안 원심분리한 다음 멸균 목초지 피펫을 사용하여 두 자당 밀도 사이의 계면에서 미엘린 파편을 수집합니다. 첫 번째 등장성 분리 및 정제를 위해 수집된 미엘린 파편 용액을 50밀리리터 원심분리기 튜브로 옮깁니다. 미리 냉각된 멸균 PBS로 부피를 35밀리리터로 조정하고 새 균질화 튜브로 옮깁니다. 3분 동안 균질화한 후, 미엘린 파편을 6개의 38.5밀리리터 멸균, 벽이 얇은 폴리프로필렌 초원심분리기 튜브에 고르게 분배합니다. 멸균 PBS로 부피를 구성한 다음 원심분리합니다. 두 번째 등장성 분리 및 정제를 위해 고체 백색 펠릿을 예냉된 멸균 PBS 10밀리리터에 재현탁하여 미엘린 파편 현탁액을 얻습니다. 현탁액을 이전과 같이 초원심분리기 튜브에 분배하고 원심분리합니다. 원심분리 후 상층액을 버립니다. 고체 흰색 펠릿을 멸균 PBS 6밀리리터에 재현탁합니다. 미엘린 파편 현탁액을 6개의 1.5 원심분리기 튜브로 나누고 다시 원심분리합니다. 마지막으로, 상청액을 버린 후 100마이크로리터의 예냉된 멸균 PBS에 펠릿을 재현탁합니다. 필요한 미엘린 파편을 섭씨 4도 또는 얼음물에서 해동하고 이전과 같이 10분 동안 원심분리합니다. 미엘린 파편을 200마이크로리터의 50마이크로몰 CFSE 용액에 재현탁합니다. 현탁액을 어두운 곳에서 실온에서 30분 동안 배양한 다음 다시 원심분리합니다. 상청액을 버린 다음 500마이크로리터의 멸균 PBS로 샘플을 세 번 세척합니다. 미엘린 파편을 100마이크로리터의 예냉된 멸균 PBS에 재현탁하여 형광 표지된 미엘린 파편의 현탁액을 얻습니다. 샘플은 더 이상 사용할 때까지 섭씨 -80도에서 보관하십시오. 체외 반복 자기 자극의 경우 치료 주파수를 20Hz로, 치료 강도를 최대 출력 강도의 1%, 자극 시간을 5초로 설정합니다. 20초의 휴식 시간을 포함하고 2.5분의 단일 치료 시간 동안 600개의 펄스를 투여합니다. 자기 자극 매개변수를 미리 결정한 후 코일 방향을 지면에 수직으로 고정하고 위쪽으로 향하게 합니다. 세포 오염을 방지하기 위해 자기 자극 코일을 알코올로 멸균하십시오. CFSE 50마이크로몰을 첨가한 후 밤새 24웰 플레이트에 1,000개의 BV-2 세포를 도금한 다음 피펫으로 오래된 배지를 흡인하고 즉시 신선한 무혈청 배지를 추가합니다. 배지를 무혈청 배지로 바꾸고 12시간 동안 밀리리터 지질다당류당 1마이크로그램으로 세포를 처리합니다. 지질다당류 개입 12시간 후, 어둠 속에서 공동 배양하기 위해 미엘린 파편 밀리리터당 100마이크로그램을 배지에 첨가합니다. 앞서 설명한 것처럼 세포에 반복적인 자기 자극을 가합니다. 인큐베이터로 되돌리기 전에 플레이트 위에 알코올을 뿌려 멸균하십시오. 미엘린 조각과 일정 기간 공동 배양한 후, 흡수되지 않은 미엘린 파편을 PBS로 부드럽게 세척합니다. 세포를 4% 파라포름알데히드로 15분 동안 고정합니다. 다음으로, 10% 당나귀 혈청 알부민과 0.3% Triton X-100을 함유한 150마이크로리터 PBS를 웰에 넣고 배양합니다. PBS로 웰을 세척한 후, 1차 항체 용액을 웰에 100 내지 200의 비율로 첨가하고 저온 속에서 배양한다. 그런 다음 공초점 현미경으로 이미징하기 전에 실온에서 2시간 동안 200 내지 300의 비율로 2차 항체에서 세포를 배양합니다. BV-2 미세아교세포는 지질다당류 처리 후 미엘린 파편 식균작용이 크게 감소했습니다. 반복적인 자기 자극 개입으로 역전되었습니다. 정량적 분석에서는 대조군에 비해 지질다당류군에서 BV-2 세포 내 미엘린 파편 면적이 유의하게 감소했으며, 지질다당류 처리된 자기 자극 그룹에서는 눈에 띄게 증가한 것으로 확인되었습니다. 미엘린 파편과 함께 국소된 IBA-1 양성 미세아교세포의 비율은 대조군에 비해 LPS 그룹에서 유의하게 낮았지만 자기 자극은 이 비율을 유의하게 증가시켰습니다. 미세아교세포 식균작용의 시간 의존적 증가는 우리 그룹의 지질다당류 처리된 자기 자극 그룹에서 상당히 더 높은 미엘린 파편 흡수를 보였다.