냉동 절제 및 면역 염색 마우스 내이 조직: 배아에서 성체 단계까지

내 연구는 달팽이관의 신경 발달에 중점을 두고 있습니다. 구체적으로, 저는 달팽이관 내 SNAPS 형성의 근본적인 메커니즘을 밝히고 알츠하이머병과 청력 상실 사이의 연관성을 조사하는 것을 목표로 합니다. 라이브 이미징 및 유전 도구는 달팽이관 구조와 신경 회로를 더 자세히 연구하는 능력을 향상시켜 감사자 시스템의 탄력성과 기능 장애에 대한 더 깊은 통찰력을 제공합니다. 이 프로토콜을 발표함으로써 우리는 감사자 과학을 처음 접하는 연구자, 특히 이전에 달팽이관을 사용해 본 적이 없는 연구자를 돕고자 합니다. 이 가이드는 배아, 신생아 및 성체 마우스의 내이 샘플을 준비하는 방법을 단계별로 설명합니다. 우리의 목표는 내이 실험을 더 쉽게 만들고 결과가 신뢰할 수 있고 일관되게 유지되도록 하는 것입니다. 단면 면역염색은 전체 마운트 면역염색과 같은 다른 방법에 비해 몇 가지 장점이 있습니다. 단백질과 핵산을 잘 보존하고 얇고 거의 2D에 가까운 단면을 생성하여 측정을 보다 정확하고 일관되게 만듭니다. 이 방법은 또한 모든 달팽이관 세포 유형을 손상되지 않고 가시적으로 유지하여 면역염색 컬트를 향상시킵니다. 전체 마운트 준비와 달리 단면은 나선형 인대, 혈관 선조, Reissner 막 및 tectorial membrane과 같은 중요한 구조를 보존합니다.

[강사] 시작하려면 안락사된 어린 마우스를 수술 플랫폼에 놓습니다. 미세한 해부 가위를 사용하여 목에서 시작하여 주둥이를 향해 두피를 따라 정중선을 조심스럽게 절개합니다. 그런 다음 가위의 아래쪽 날을 대구공에 놓고 위쪽 날을 두개골에 놓습니다. 두개골의 위쪽 절반을 코까지 잘라 두 번째 절단을 완료합니다. 부분적으로 절개된 머리에서 가위를 되돌립니다. 가위의 아래쪽 날을 두개골 바닥에 놓고 위쪽 날을 대골공에 놓습니다. 머리의 아래쪽 절반을 코까지 잘라 세 번째 자르기를 완성합니다. 가는 집게와 가위를 사용하여 뇌, 근육 및 결합 조직을 포함하여 측두골을 둘러싼 연조직을 조심스럽게 분리합니다. 다음으로, 마우스 반쪽 머리를 PBS가 포함된 24웰 플레이트의 웰에 넣습니다. 고정을 위해 PBS를 4% 파라포름알데히드 용액으로 교체하고 실온에서 45분 동안 배양합니다. 고정 후 PBS로 5-10분 동안 조직을 세 번 헹굽니다. 마우스 반쪽 머리 내에서 측두골 또는 내이낭을 찾습니다. 미세한 집게를 사용하여 내이낭을 둘러싼 연조직을 조심스럽게 분리합니다. 풀리면 내이낭 주변의 조직을 자릅니다. 그런 다음 집게를 사용하여 내이낭 주변 부위에 부드럽게 압력을 가하여 완전히 풀어줍니다. 내이 샘플을 섭씨 4도의 PBS에 보관합니다. 시작하려면 안락사된 성체 마우스를 수술 플랫폼에 놓습니다. 날카로운 해부 가위를 사용하여 목에서 시작하여 주둥이를 향해 확장하여 두피를 따라 정중선을 절개합니다. 첫 번째 절단 중에 두개골을 노출시키기 위해 피부를 뒤로 접습니다. 가위의 아래쪽 날을 대구공에 놓고 위쪽 날을 두개골에 놓습니다. 두개골의 위쪽 절반을 코까지 잘라 두 번째 절단을 완료합니다. 부분적으로 절개된 머리에서 가위를 되돌립니다. 하단 블레이드를 두개골 기저부에 배치하고 상단 블레이드를 대공에 배치합니다. 내이를 피하고 정중선을 따라 머리의 아래쪽 절반을 코까지 자릅니다. 각 반쪽 머리에 대해 집게와 가위를 사용하여 뇌, 근육 및 결합 조직을 포함하여 측두골을 둘러싼 연조직을 분리합니다. 그런 다음 손가락으로 두개골 조직을 역으로 말리고 엄지손가락을 사용하여 측두골 아래쪽에 부드러운 압력을 가합니다. 주변 부착물에서 뼈를 점차적으로 풉니다. 내이낭을 제거한 후 PBS로 철저히 헹굽니다. 4% 파라포름알데히드로 채워진 Sylgard 접시를 현미경으로 놓습니다. 접시에 단일 내부 이어 캡슐을 배치합니다. 내이에 부착된 연조직이나 뼈가 있는지 검사하고 부드럽게 제거합니다. 타원형 창을 식별하고 겸자를 사용하여 등골을 부드럽게 제거합니다. 다음으로 미세한 집게를 사용하여 달팽이관 정점에 작은 구멍을 엽니다. 20% 파라포름알데히드로 채워진 P4 피펫을 사용하여 달팽이관을 세척하여 희석된 혈액이나 내림프와 같은 체액이 타원형 창을 통해 빠져나오도록 합니다. 고정된 달팽이관을 4% 파라포름알데히드로 채워진 24웰 플레이트로 옮깁니다. 시간을 표시하고 로커 또는 장동을 사용하여 부드럽게 교반하면서 30-60분 동안 배양합니다. 배양 후 PBS로 5-10분 동안 샘플을 세 번 헹굽니다. 최종 헹굼 후 달팽이관을 1.25밀리몰 EDTA에 넣고 섭씨 4도에서 2-3일 동안 흔들게 합니다. EDTA 처리 후 PBS로 달팽이관을 5분 동안 3회 헹굽니다. 시작하려면 해부된 내이 캡슐을 10% 자당 용액에 넣고 실온에서 2시간 동안 배양합니다. 배양 후 10% 자당 용액을 20% 자당으로 교체하고 2시간 더 배양합니다. 그런 다음 20% 자당 용액을 30% 자당으로 교체하고 샘플을 섭씨 4도에서 밤새 배양합니다. 다음날 30% 자당 용액의 절반을 제거합니다. 최적의 절단 온도 또는 OCT 컴파운드로 공간을 채우고 샘플을 30분에서 2시간 동안 흔들게 합니다. 샘플을 OCT 화합물로 채워진 라벨이 부착된 크라이오몰드로 옮깁니다. 내장된 cryoblock에서 달팽이관의 방향을 확인하십시오. 내이를 확인하십시오. 의 오목한 면은 표준 인공와우 단면을 위해 Cryomold의 좁은 측면을 향합니다. 그런 다음 작은 용기에 드라이아이스를 넣고 5-10밀리리터의 디메틸부탄을 추가합니다. OCT가 포함된 냉동몰드와 샘플을 거품이 나는 드라이아이스 위에 놓아 블록을 빠르게 얼립니다. 극저온 블록을 섭씨 영하 20도로 미리 냉각된 극저온 조절기의 챔버로 옮깁니다. 샘플이 30-60분 동안 평형을 이루도록 합니다. 연필이나 펜을 사용하여 인공와우 위치에 해당하는 냉동 블록의 측면을 표시하여 절편을 위한 올바른 방향을 확인합니다. 그런 다음 척에 작은 OCT 풀을 추가하고 그 위에 크라이오 블록을 놓고 연필 자국이 없는 넓은 면이 아래를 향하도록 합니다. OCT와 샘플이 들어 있는 척을 냉각된 극저온 조절기 챔버에 넣어 OCT가 완전히 얼도록 합니다. 몇 분 후 샘플이 담긴 척을 오른쪽 또는 왼쪽을 가리키는 연필 표시가 있는 척 홀더 위에 놓습니다. 극저온 조절기에서 조직이 분명해질 때까지 40마이크로미터 설정을 사용하여 블록을 다듬습니다. 조직이 명백해지면 냉동 절편용으로 설계된 슬라이드를 사용하여 12마이크로미터 절편을 수확합니다. 현미경으로 절편 위치를 확인하십시오. 달팽이관 회전에 접근하면 12마이크로미터 절편을 계속 수확하고 모든 달팽이관 회전이 절단될 때까지 주기적으로 위치를 확인합니다.