Isolation of Live Myeloid and Epithelial Cell Populations from the Mouse Lung(쥐 폐에서 살아있는 골수성 및 상피 세포 집단의 분리)

우리는 바이러스 감염 후 폐 복구를 연구합니다. 우리는 면역 세포가 상피 복구를 매개하는 메커니즘과 바이러스 손상 후 리모델링과 후속 복구가 향후 질병 병리에 어떤 영향을 미칠 수 있는지 이해하는 것을 목표로 합니다. 이 프로토콜은 상피 및 기질 세포 또는 면역 세포에 최적화된 폐 소화물의 부적합성을 해결합니다.

우리의 연구는 면역 및 비면역 구획 모두에서 생존 가능한 세포를 분리하는 것을 필요로 합니다. 또한, 우리는 상피 및 대식세포 하위 집합에 대한 게이팅 전략을 제시했으며, 이는 이 분야에 도움이 되기를 바랍니다. 우리 실험실은 정상적인 상태 조건에서 환경 문제에 대응하여 호흡기의 면역 세포와 상피 세포 사이의 혼선을 조사합니다.

우리의 궁극적인 목표는 조직 복구를 향상시키고 질병 발병을 예방하기 위해 이러한 소통을 조절하는 최선의 방법을 결정하는 것입니다. 시작하려면 마우스에 70% 에탄올을 뿌립니다. 가는 수술용 가위와 7번 집게를 사용하여 복부를 절개하고 복막을 옆으로 자릅니다.

진공을 해제하기 위해 다이어프램을 작게 자릅니다. 그런 다음 체강에서 횡격막과 하부 흉곽을 잘라내어 폐와 심장을 노출시킵니다. 27게이지 바늘이 장착된 10ml 주사기를 사용하여 DPBS에서 5ml의 2밀리리터 EDTA를 폐에 관류합니다.

흉골을 통해 측면을 따라 수직으로 절단하여 흉곽을 열고 기관을 노출시킵니다. 가는 가위와 7번 집게를 사용하여 기관이나 폐에 구멍을 뚫지 않고 가능한 한 많은 근육과 결합 조직을 제거합니다. 그런 다음 기관을 2/0 봉합사로 감싸고 묶는 것처럼 위치시키되 조이지 마십시오.

기관에 측면 흠집을 내고 카테터를 삽입합니다. 그런 다음 봉합사를 단단히 당겨 카테터를 제자리에 고정합니다. 주사기를 사용하여 1ml의 DPBS로 폐를 팽창시킵니다.

그런 다음 주사기를 천천히 뒤로 당겨 DPBS를 빼냅니다. 동일한 DPBS로 폐를 다시 팽창시키고 다시 주사기를 당겨 기관지폐포 세척액(BAL)을 수집합니다. 카테터를 삽입한 상태로 카테터에서 주사기를 분리합니다.

수집된 밸브를 마이크로 원심분리기 튜브에 분배합니다. 다음으로, 동일한 1ml 주사기에 1ml의 dispase를 채웁니다. 주사기를 카테터에 부착하고 디스파제로 폐를 팽창시킵니다.

카테터를 제거하는 동안 기관 주변의 봉합사를 조여 디스파제의 누출을 방지합니다. 가위를 사용하여 기관을 옆으로 자릅니다. 폐와 기관을 위로 당기면서 흉곽 뒤쪽을 따라 결합 조직을 절단하여 체강에서 폐를 제거합니다.

그런 다음 폐에서 심장을 제거합니다. 얼음 위에 5ml의 DPBS에 폐를 놓습니다. 400G에서 섭씨 4도에서 5분간 원심분리기 밸브.

피펫을 사용하여 상층액을 흡입하고 펠릿을 100마이크로리터의 RPMI에 재현탁합니다. 먼저 쥐에서 채취한 폐의 5개 엽을 해부하고 결합 조직을 버립니다. 절개된 폐 조직을 유리 슬라이드에서 가위로 1분 동안 자릅니다.

해부 가위를 사용하여 다진 폐 조직을 50ml 원심분리기 튜브로 옮깁니다. 그런 다음 3ml의 소화 혼합물을 넣고 폐 소화 혼합물을 위아래로 2-3회 피펫팅합니다. 마지막으로, RPMI에 재현탁된 BAL에서 회수된 세포 펠릿을 추가합니다.

섭씨 37도에서 45분 동안 섭씨 140RPM으로 설정된 오비탈 셰이커에 튜브를 40도 각도로 놓습니다. 배양 후 셰이커에서 튜브를 제거하고 얼음 위에 놓습니다. 폐 소화 혼합물을 5-6회 위아래로 피펫팅합니다.

70마이크로미터 셀 스트레이너를 통해 혼합물을 새 50ml 튜브로 여과합니다. 필터를 통해 남아 있는 세포를 세척하고 RPMI 배지에서 10ml의 5%FBS로 효소를 중화합니다. 600G에서 섭씨 4도에서 5분 동안 시료를 원심분리합니다.

진공 흡입기를 사용하여 상층액을 흡입합니다. 세포 펠릿을 1ml의 ACK 용해 완충액에 재현탁시키고 실온에서 3분 동안 배양하여 적혈구를 용해합니다. 그런 다음 9ml의 PBS와 피펫을 위아래로 첨가하여 용액을 혼합합니다.

다시 샘플을 원심분리하고 진공 흡입기를 사용하여 상층액을 제거한 다음 세포 펠릿을 1ml의 형광 활성화 세포 분류 버퍼에 다시 현탁시킵니다. 유세포 분석을 위해 64마이크로미터 메쉬를 통해 현탁액을 마이크로 원심분리 튜브로 필터링합니다.