Name: 단일 세포 수준에서 키메라 항원 수용체 T 세포를 평가하기 위한 액적 기반 세포 독성 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-03-14T14:20:00.000+00:00
Duration: 8 min 9 s
Description: 학습하세요 액적 기반 세포 독성 분석을 통해 단일 세포 수준에서 CAR T 세포의 기능적 다양성과 세포독성 활성을 평가하는 방법을 알아보세요. 이 기술은 암 면역치료 연구에 활용됩니다.

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<ol><li>Pasqui, D. M., Latorraca, C. D. O. C., Pacheco, R. L., Riera, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CAR-T+cell+therapy+for+patients+with+hematological+malignancies.+A+systematic+review%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Haematol%22%5BJournal%5D)">CAR-T cell therapy for patients with hematological malignancies. A systematic review.</a> Eur J Haematol. 109 (6), 601-618 (2022).</li>
<li>Krejcik, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Harnessing+the+immune+system+to+fight+multiple+myeloma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers%22%5BJournal%5D)">Harnessing the immune system to fight multiple myeloma.</a> Cancers. 13 (18), 4546(2021).</li>
<li>Tokarew, N., Ogonek, J., Endres, S., von Bergwelt-Baildon, M., Kobold, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Teaching+an+old+dog+new+tricks%3A+next-generation+CAR+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22British+J+Cancer%22%5BJournal%5D)">Teaching an old dog new tricks: next-generation CAR T cells.</a> British J Cancer. 120 (1), 26-37 (2019).</li>
<li>Bogetofte Barnkob, M., Vitting-Seerup, K., Rønn Olsen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Target+isoforms+are+an+overlooked+challenge+and+opportunity+in+chimeric+antigen+receptor+cell+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Immunother+Adv%22%5BJournal%5D)">Target isoforms are an overlooked challenge and opportunity in chimeric antigen receptor cell therapy.</a> Immunother Adv. 2 (1), ltac009(2022).</li>
<li>Daei Sorkhabi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+current+landscape+of+CAR+T-cell+therapy+for+solid+tumors%3A+Mechanisms%2C+research+progress%2C+challenges%2C+and+counterstrategies%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">The current landscape of CAR T-cell therapy for solid tumors: Mechanisms, research progress, challenges, and counterstrategies.</a> Front Immunol. 14, 1113882(2023).</li>
<li>Considerations for the Development of Chimeric Antigen Receptor (CAR) T Cell Products. , Center for Biologics Evaluation and Research. 
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<li>Roddie, C., O'Reilly, M., Dias Alves Pinto, J., Vispute, K., Lowdell, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Manufacturing+chimeric+antigen+receptor+T+cells%3A+issues+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">Manufacturing chimeric antigen receptor T cells: issues and challenges.</a> Cytotherapy. 21 (3), 327-340 (2019).</li>
<li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improvement+of+in+vitro+potency+assays+by+a+resting+step+for+clinical-grade+chimeric+antigen+receptor+engineered+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">Improvement of in vitro potency assays by a resting step for clinical-grade chimeric antigen receptor engineered T cells.</a> Cytotherapy. 21 (5), 566-578 (2019).</li>
<li>Burrows, S. R., Fernan, A., Argaet, V., Suhrbier, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bystander+apoptosis+induced+by+CD8%2B+cytotoxic+T+cell+%28CTL%29+clones%3A+implications+for+CTL+lytic+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Immunol%22%5BJournal%5D)">Bystander apoptosis induced by CD8+ cytotoxic T cell (CTL) clones: implications for CTL lytic mechanisms.</a> Int Immunol. 5 (9), 1049-1058 (1993).</li>
<li>Gattinoni, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acquisition+of+full+effector+function+in+vitro+paradoxically+impairs+the+in+vivo+antitumor+efficacy+of+adoptively+transferred+CD8%2B+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Acquisition of full effector function in vitro paradoxically impairs the in vivo antitumor efficacy of adoptively transferred CD8+ T cells.</a> J Clin Invest. 115 (6), 1616-1626 (2005).</li>
<li>Chen, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrative+bulk+and+single-cell+profiling+of+premanufacture+T-cell+populations+reveals+factors+mediating+long-term+persistence+of+CAR+T-cell+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Dis%22%5BJournal%5D)">Integrative bulk and single-cell profiling of premanufacture T-cell populations reveals factors mediating long-term persistence of CAR T-cell therapy.</a> Cancer Dis. 11 (9), 2186-2199 (2021).</li>
<li>Frazer, G. L., Gawden-Bone, C. M., Dieckmann, N. M. G., Asano, Y., Griffiths, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signal+strength+controls+the+rate+of+polarization+within+CTLs+during+killing%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Signal strength controls the rate of polarization within CTLs during killing.</a> J Cell Biol. 220 (10), e202104093(2021).</li>
<li>Hermans, I. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+VITAL+assay%3A+a+versatile+fluorometric+technique+for+assessing+CTL-+and+NKT-mediated+cytotoxicity+against+multiple+targets+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Meth%22%5BJournal%5D)">The VITAL assay: a versatile fluorometric technique for assessing CTL- and NKT-mediated cytotoxicity against multiple targets in vitro and in vivo.</a> J Immunol Meth. 285 (1), 25-40 (2004).</li>
<li>Zaritskaya, L., Shurin, M. R., Sayers, T. J., Malyguine, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+flow+cytometric+assays+for+monitoring+cell-mediated+cytotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Rev+Vaccines%22%5BJournal%5D)">New flow cytometric assays for monitoring cell-mediated cytotoxicity.</a> Expert Rev Vaccines. 9 (6), 601-616 (2010).</li>
<li>Piccinini, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+CAR-T+cell+killing%3A+validation+of+the+potency+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Immunol+Immunother+CII%22%5BJournal%5D)">In vitro CAR-T cell killing: validation of the potency assay.</a> Cancer Immunol Immunother CII. 73 (9), 168(2024).</li>
<li>Martinez, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+flow+cytometric+method+for+the+simultaneous+measurement+of+CAR-T+cell+characterization+and+cytotoxicity+against+solid+tumor+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22SLAS+Disc+Adv+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">High-throughput flow cytometric method for the simultaneous measurement of CAR-T cell characterization and cytotoxicity against solid tumor cell lines.</a> SLAS Disc Adv Life Sci. 23 (7), 603-612 (2018).</li>
<li>Jedema, I., van der Werff, N. M., Barge, R. M. Y., Willemze, R., Falkenburg, J. H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+CFSE-based+assay+to+determine+susceptibility+to+lysis+by+cytotoxic+T+cells+of+leukemic+precursor+cells+within+a+heterogeneous+target+cell+population%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">New CFSE-based assay to determine susceptibility to lysis by cytotoxic T cells of leukemic precursor cells within a heterogeneous target cell population.</a> Blood. 103 (7), 2677-2682 (2004).</li>
<li>Liu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+and+molecular+imaging+of+CAR-T+cell-based+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Drug+Delivery+Rev%22%5BJournal%5D)">Cellular and molecular imaging of CAR-T cell-based immunotherapy.</a> Adv Drug Delivery Rev. 203, 115135(2023).</li>
<li>Liadi, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+potency+of+CAR%2B+T+cells%3A+Fast+and+furious+or+slow+and+steady%5BTitle%5D)+AND+%22Oncoimmunology%22%5BJournal%5D)">Defining potency of CAR+ T cells: Fast and furious or slow and steady.</a> Oncoimmunology. 8 (10), e1051298(2019).</li>
<li>Xhangolli, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+analysis+of+CAR-T+cell+activation+reveals+a+mixed+TH1%2FTH2+response+independent+of+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Genom+Proteom+Bioinfo%22%5BJournal%5D)">Single-cell analysis of CAR-T cell activation reveals a mixed TH1/TH2 response independent of differentiation.</a> Genom Proteom Bioinfo. 17 (2), 129-139 (2019).</li>
<li>Zhou, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+single-cell+cytokine+secretion+and+cell-cell+interactions+with+a+hierarchical+loading+microwell+chip%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Evaluation of single-cell cytokine secretion and cell-cell interactions with a hierarchical loading microwell chip.</a> Cell Rep. 31 (4), 107574(2020).</li>
<li>LaBelle, C. A., Zhang, R. J., Hunsucker, S. A., Armistead, P. M., Allbritton, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microraft+arrays+for+serial-killer+CD19+chimeric+antigen+receptor+T+cells+and+single+cell+isolation%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+J+Int+Soc+Anal+Cytol%22%5BJournal%5D)">Microraft arrays for serial-killer CD19 chimeric antigen receptor T cells and single cell isolation.</a> Cytometry J Int Soc Anal Cytol. 103 (3), 208-220 (2023).</li>
<li>Hellmann, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneously+deacetylated+chitosans+possess+an+unexpected+regular+pattern+favoring+acetylation+at+every+third+position%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Comm%22%5BJournal%5D)">Heterogeneously deacetylated chitosans possess an unexpected regular pattern favoring acetylation at every third position.</a> Nat Comm. 15 (1), 6695(2024).</li>
<li>Wong, K. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+chimeric+antigen+receptor+T+cytotoxicity+by+droplet+microfluidics+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Antibody+Therapeut%22%5BJournal%5D)">Assessment of chimeric antigen receptor T cytotoxicity by droplet microfluidics in vitro.</a> Antibody Therapeut. 5 (2), 85-99 (2022).</li>
<li>Antona, S., Platzman, I., Spatz, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Droplet-based+cytotoxicity+assay%3A+Implementation+of+time-efficient+screening+of+antitumor+activity+of+natural+killer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+omega%22%5BJournal%5D)">Droplet-based cytotoxicity assay: Implementation of time-efficient screening of antitumor activity of natural killer cells.</a> ACS omega. 5 (38), 24674-24683 (2020).</li>
<li>Subedi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+automated+real-time+microfluidic+platform+to+probe+single+NK+cell+heterogeneity+and+cytotoxicity+on-chip%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">An automated real-time microfluidic platform to probe single NK cell heterogeneity and cytotoxicity on-chip.</a> Sci Rep. 11 (1), 17084(2021).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+CRISPR%2FCas12a-based+quantitative+detection+of+nucleic+acids+using+double+emulsion+droplets%5BTitle%5D)+AND+%22Biosens+Bioelect%22%5BJournal%5D)">Enhanced CRISPR/Cas12a-based quantitative detection of nucleic acids using double emulsion droplets.</a> Biosens Bioelect. 257, 116339(2024).</li>
<li>Kochenderfer, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+and+preclinical+evaluation+of+an+anti-CD19+chimeric+antigen+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunother%22%5BJournal%5D)">Construction and preclinical evaluation of an anti-CD19 chimeric antigen receptor.</a> J Immunother. 32 (7), 689-702 (2009).</li>
<li>Michaels, Y. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precise+tuning+of+gene+expression+levels+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Comm%22%5BJournal%5D)">Precise tuning of gene expression levels in mammalian cells.</a> Nat Comm. 10 (1), 818(2019).</li>
<li>Yuan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Droplet+encapsulation+improves+accuracy+of+immune+cell+cytokine+capture+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Droplet encapsulation improves accuracy of immune cell cytokine capture assays.</a> Lab on a Chip. 20 (8), 1513-1520 (2020).</li>
<li>Brower, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Double+emulsion+flow+cytometry+with+high-throughput+single+droplet+isolation+and+nucleic+acid+recovery%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Double emulsion flow cytometry with high-throughput single droplet isolation and nucleic acid recovery.</a> Lab on a Chip. 20 (12), 2062-2074 (2020).</li>
<li>Kirouac, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deconvolution+of+clinical+variance+in+CAR-T+cell+pharmacology+and+response%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Deconvolution of clinical variance in CAR-T cell pharmacology and response.</a> Nat Biotechnol. 41 (11), 1606-1617 (2023).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Reagents</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Blocker BSA (BSA)</td><td>Thermo Scientific</td><td>37525</td><td></td></tr><tr><td>CellTrace 원적혈구 증식 키트(원적외선 형광 염료)</td><td>Invitrogen</td><td>C34564</td><td></td></tr><tr><td>CellTrace 바이올렛 세포 증식 키트(바이올렛 형광 염료)</td><td>Invitrogen</td><td>C34557</td><td></td></tr><tr><td>DE 안정화 용액( 안정화 솔루션)</td><td>Samplix</td><td>REDIVSTABSOL1500</td><td></td></tr><tr><td>DPBS (dPBS)</td><td>Gibco</td><td>14190-094</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s PBS (dPBS)</td><td>Capricorn Scientific</td><td>PBS-1A</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads Human T-Activator (CD3/CD28 activation beads)</td><td>Gibco</td><td>11132D</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>Capricorn Scientific</td><td>FBS-HI-12A</td><td></td></tr><tr><td>Lenti-X Concentrator (PEG 기반 시약)</td><td>Takara Bio</td><td>631232</td><td></td></tr><tr><td>MACSelect LNGFR Microbeads (anti-NGFR magnetic beads)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-330</td><td></td></tr><tr><td>OptiPrep 밀도 구배 매체 (경사 매체)</td><td>스템셀</td><td>7820</td><td></td></tr><tr><td>페니실린-스트렙토마이신 (P/S)</td><td>염소자리 과학</td><td>PS-B</td><td></td></tr><tr><td>요오드화 프로피듐 (PI)</td><td>인비트로겐</td><td>BMS500PI</td><td></td></tr><tr><td>재조합 인간 IL-2 (IL-2)</td><td>페프로텍</td><td>200-02</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640 안정 글루타민 ( RPMI-1640)</td><td>Capricorn Scientific</td><td>RPMI-STA</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640 L-글루타민 및 페놀 레드</td><td>없음 Gibco</td><td>32404-014</td><td></td></tr><tr><td>Xdrop DE oil I (oil)</td><td>Samplix</td><td>REOILDEC1900</td><td></td></tr><tr><td>Xdrop Granzyme B substrate (GzmB substrate)</td><td>Samplix</td><td>REGRB100</td><td></td></tr><tr><td>Zombie-NIR viability dye (viability dye)</td><td>BioLegend</td><td>423106</td><td></td></tr><tr><td>Plasticware 등</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>8-chamber glass slide</td><td>Chemometec</td><td>942-0003</td><td></td></tr><tr><td>Cell culture plate, 12 well</td><td>TH Geyer</td><td>7696791</td><td></td></tr><tr><td>DNA LoBind tube, 2 mL (DNA tube)</td><td>Eppendorf</td><td>30108078</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf tube, 1.5 mL (1.5 mL tube)</td><td>Eppendorf</td><td>30108051</td><td></td></tr><tr><td>Falcon tube, 15 mL ( 15 mL 튜브)</td><td>TPP</td><td>91015</td><td></td></tr><tr><td>Falcon tube, 5 mL (5 mL tube)</td><td>Falcon (VWR)</td><td>734-0443</td><td></td></tr><tr><td>세포 배양용 녹색 세포 현탁 플라스크 (T75 플라스크)</td><td>Sarstedt</td><td>148.19.22</td><td></td></tr><tr><td>세포 배양용 녹색 세포 현탁 플레이트(96 웰 플레이트)</td><td>Sarstedt</td><td>148.32.20</td><td></td></tr><tr><td>LS 분리 컬럼(분리 컬럼)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>Xdrop DE 개스킷 (개스킷)</td><td>Samplix</td><td>#GADEA100</td><td></td></tr><tr><td>Xdrop DE50 카트리지 (캡슐화 카트리지)</td><td>Samplix</td><td>#CADE50A100</td><td></td></tr><tr><td>항체</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>anti-CCR7 PE-Dazzle 594</td><td>BioLegend</td><td>353236</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD19 CAR FMC63 Idiotype 항체, PE</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-127-342</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD3 APC</td><td>Biolegend</td><td>300439</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD3 BV480</td><td>BD Biosciences</td><td>566105</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD3 FITC</td><td>BD Biosciences</td><td>345763</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD4 BUV661</td><td>BD Biosciences</td><td>612962</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD4 StarBright Violet 760</td><td>Bio-Rad</td><td>MCA1267SBV760T</td><td></td></tr><tr><td>항-CD45RA, BUV395</td>, <td>BD Biosciences</td><td>740298</td><td></td>,</tr><tr><td>항-CD8, PE-Cy7</td>, <td>BioLegend</td><td>344712,</td> 항<td></td></tr><tr><td>-CD8, StarBright, Violet</td>, <td>Bio-Rad</td><td>MCA1226SBV760</td><td></td></tr>, <tr><td>항-NGFR, FITC</td>, <td>BioLegend</td><td>345106</td><td></td></tr>, <tr><td>항-NGFR, PE, BioLegend 항-NGFR PE</td>, <td>BioLegend</td><td></td> 345106<td></td></tr><tr><td><강한>세포</강한></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>JeKo-1 맨틀 세포 림프종 세포주(JeKo-1)</td><td>ATCC</td><td>CRL-3006</td><td></td></tr><tr><td>일차 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Countess 3 자동 세포 계수기</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A50298</td><td></td></tr><tr><td>DynaMag-2 Magnet</td><td>Invitrogen</td><td>12321D</td><td></td></tr><tr><td>NovoCyte Quanteon 유세포 분석기 (유세포 분석기)</td><td>Agilent</td><td>2010011AA</td><td></td></tr><tr><td>Xdrop (microfluidics device)</td><td>Samplix</td><td>IN00110-EU</td><td></td></tr></tbody></table>

단일 세포 수준에서 키메라 항원 수용체 t 세포를 평가하기 위한 액적 기반 세포 독성 분석

Droplet-based Cytotoxicity Assay to Assess Chimeric Antigen Receptor T cells at the Single-cell Level

형질도입 후, 항-CD3 및 항-NGFR 항체를 사용하여 유세포 분석으로 T 세포의 CAR 발현을 분석했습니다. 이후 CAR T 세포 집단은 anti-NGFR 마그네틱 비드를 사용하여 농축되어 두 공여자에 대해 98% 이상의 순도를 달성했습니다(그림 1A-B). 사용된 분류된 CAR 세포의 CD4/CD8 비율 및 메모리 표현형도 CCR7 및 CD45RA 항체를 활용하는 표준 게이트 전략을 사용하여 정량화했습니다. 이 데이터는 사용된 CAR T 세포의 CD4/CD8 비율이 0.73이었고 세포는 주로 나이브와 유사한 메모리 표현형임을 보여줍니다(그림 1C-E).
CAR T 세포와 JeKo-1 세포를 각각 보라색 및 원적외선 염료로 염색하고 분석 시약 GzmB 기질 및 PI와 함께 DE50 방울에 캡슐화했습니다(그림 2). 또는 anti-CD4 또는 anti-CD8과 같은 항체를 사용하여 CAR T 세포를 표지할 수도 있으므로(그림 3) T 세포의 특성을 보다 자세히 분석할 수 있습니다. 각 T 세포 현탁액(CAR T 또는 NTD)을 효과기에서 캡슐화 직전에 JeKo-1 세포 현탁액과 혼합하였다: 1:3의 표적 세포 비율(0.5 x 106 T 세포 및 1.5 x 106 JeKo-1). 캡슐화 후, 각 액적 생산(CAR T 세포 + JeKo-1 및 NTD + JeKo-1)을 각각 2시간, 4시간 및 6시간 배양을 위해 3개의 배양 튜브로 분할했습니다. 세포를 37°C에서 5%CO2 로 액적 내부에서 배양한 다음 표시된 시점에서 현미경 및 유세포 분석으로 분석했습니다.
우리는 배양 4시간 후 이중 에멀젼 방울에 대한 형광 현미경을 수행했습니다(그림 4). 녹색 형광 신호(FITC)의 강도는 DE50 방울 내에서 CAR T 세포 또는 NTD의 분비된 GzmB 활성 수준을 보여줍니다. 그림 4B 는 CAR T 세포와 JeKo-1 표적 세포가 밀접하게 접촉하는 단일 GzmB 양성 액적의 위상차 및 형광 현미경 이미지를 보여줍니다.
다음으로, DE50 방울을 유세포 분석법으로 분석하여 초기 GzmB 분비 및 세포독성 세포 사멸 활성을 보이는 CAR T 세포의 비율을 정량화했습니다(그림 5). 캡슐화 전에 JeKo-1 표적 세포를 원적외선 염료로 염색하고 effector T 세포를 보라색 염료로 사전 배양 염색하면 세포가 푸아송 분포에 따라 액적으로 분포함에 따라 3개의 별개의 세포 함유 액적 집단을 쉽게 식별할 수 있었습니다. 확인된 액적 집단은 T 세포만 있는 액적, JeKo-1 세포만 있는 액적, T 세포와 JeKo-1 세포가 함께 있는 액적입니다(그림 5A). T 세포와 JeKo-1 세포를 함께 캡슐화하는 액적을 게이트하고 PI(그림 5C)에서 알 수 있듯이 GzmB 활성(그림 5B) 및 세포 사멸을 나타내는 신호에 대해 분석했습니다.
액적에서 세포의 캡슐화는 푸아송 분포를 따르며 4개의 서로 다른 액적 집단을 얻습니다(그림 6A). 그림 6B 는 자발적인 GzmB 분비 T 세포의 비율을 결정할 수 있는 방울을 6시간 배양 한 후 모든 방울 집단 내에서 GzmB 양성 방울의 수준을 보여줍니다. 이러한 데이터는 CAR T 세포만 GzmB를 분비하기 때문에 이 방법의 높은 특이성을 나타냅니다.
마지막으로, 2시간, 4시간 및 6시간의 공동 배양 후 시점에 걸쳐 GzmB 및 PI 수준을 정량화했습니다. 참고로, T 세포와 JeKo-1 세포만 포함하는 방울을 분석하여 각 집단의 배경 세포 사멸을 조사했습니다(그림 6C). 배경 세포 사멸은 3.3단계에서 설명한 바와 같이 효과기 세포 집단에서 살아있는 GzmB 분비 및 표적 세포 사멸 T 세포의 비율을 결정하는 데 사용되었습니다(그림 7). 두 명의 공여자로부터 얻은 CAR T 세포는 표적 세포 유도 GzmB 분비와 세포 사멸 활성 모두에서 시간 의존적 증가를 보였다. 공여자 1의 살아있는 CAR T 세포의 거의 36%와 공여자 2의 살아있는 CAR T 세포의 약 31%가 표적 세포와 6시간 동시 캡슐화 후 GzmB를 분비했으며, 이는 NTD 대조 T 세포에 비해 현저히 증가한 수치입니다(그림 7A). 이에 상응하여, 살아있는 공여자 1의 약 21%와 살아있는 공여자 2 CAR T 세포의 약 22%가 표적 세포를 사멸시켰으며, 이는 양성 PI 신호로 나타났습니다(그림 7B). GzmB를 분비한 CAR T 세포의 비율은 각 시점에서 사멸된 표적 세포의 비율을 초과했으며, 이는 GzmB 매개 세포독성에서 예상되는 사건 순서와 일치했습니다. 종합하면, 이러한 데이터는 여기에 제시된 방법이 세포 집단 내에서 개별 T 세포 독성의 이질성을 특성화하고 서로 다른 집단 간의 비교를 가능하게 한다는 것을 보여줍니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67657/67657fig01.jpg"> 
그림 1: NGFR 분류에 따른 대표적인 유세포 분석 플롯. (A) 약 10일간의 확장 후, NGFR 특이적 마이크로비드 및 자기 분류를 사용하여 CAR T 세포를 분류하여 &gt;98% CAR T 세포인 CAR T 세포 집단을 생성했습니다. (B) 분류 전과 후 본 연구에 사용된 2명의 기증자로부터 얻은 CAR T 세포의 정량화. (C) T 세포의 CD4/CD8 비율 및 기억 표현형을 조사하는 데 사용되는 게이팅 전략. (D) 사용된 T 세포의 CD4 및 CD8 정량화. (E) 사용된 T 세포의 기억 표현형의 정량화. 약칭 : CM = 중앙 메모리, EM = 이펙터 메모리, NTD = 비 형질 전환, TEMRA = 말단 분화 이펙터 세포. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67657/67657fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67657/67657fig02.jpg"> 
그림 2: 액적에서 단일 세포 분해능을 가진 결합된 GzmB 분비 및 세포 독성 분석을 위한 워크플로우. DE 액적에 캡슐화하기 전에 표적 세포와 효과기 세포는 보라색 및 원적외선 세포 염색을 사용하여 별도로 염색됩니다. 미세유체역학(microfluidics) 장치와 캡슐화 카트리지를 사용하여 이펙터 세포는 세포 배지, PI 및 FAM 표지된 GzmB 펩타이드 기질과 함께 액적의 표적 세포와 함께 공동 캡슐화됩니다. 분석 및 배양은 액적 내에서 발생합니다. 분비된 GzmB 활성은 GzmB가 기판을 절단한 후 발생하는 녹색 형광의 방출로 표시됩니다. 세포 사멸은 PI로 표시됩니다. 배양 후 DE50 액적은 현미경 및/또는 유세포 분석으로 분석됩니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67657/67657fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67657/67657fig03.jpg"> 
그림 3: anti-CD3, anti-CD4 및 anti-CD8 항체로 사전 라벨링된 액적 캡슐화 PBMC의 분석. (A) 항-CD3(APC) 및 항-CD4(NIR) 항체로 사전 라벨링된 캡슐화된 PBMC가 있는 비말의 현미경 이미지. 스케일바 = 100 μm. (B) As (A), 그러나 대신 CD3 (FITC) 및 anti-CD8 (NIR) 라벨링이 있습니다. 스케일바 = 100 μm. (C) 동일한 액적의 유세포 분석 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67657/67657fig03large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67657/67657fig04.jpg"> 
그림 4: effector 및 target cell이 있는 비말의 현미경 이미지. 이미지는 표준 37°C, 5% CO2 가습 세포 인큐베이터에서 4시간 배양 후 촬영되었습니다. (A) 캡슐화된 NTD 및 JeKo-1 세포(왼쪽) 또는 CAR T 세포와 JeKo-1 세포(오른쪽)가 있는 샘플의 방울을 GzmB 양성(녹색) 방울을 검출하기 위해 FITC 채널을 사용하여 형광 현미경으로 이미지화했습니다. 스케일바 = 500μm. (B) 위상차, FITC(GzmB), APC(JeKo-1 셀) 및 DAPI(CAR T 셀)로 이미지화된 단일 액적. 스케일바 = 100μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67657/67657fig04large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67657/67657fig05.jpg"> 
그림 5: 배양 후 유세포 분석으로 액적을 분석하기 위한 게이팅 전략. (A) 게이팅은 액적을 식별하기 위해 전방 및 측면 산란에 의해 수행되었으며, 그 후 액적을 포함하는 게이트를 선택했습니다. 게이트 외부의 이벤트는 이중 에멀젼 액적 생산의 부산물로 생성되는 기름 방울을 나타냅니다. 적용된 세포 염색에 해당하는 채널의 방울에 대한 후속 형광 분석은 4개의 방울 집단을 식별합니다: T 세포와 JeKo-1 세포를 모두 포함하는 방울(빨간색 사각형); JeKo-1 세포만 있는 비말; T 세포만 있는 비말; 그리고 빈 물방울. (B) 시점 및 NTD와 CAR T 세포 사이의 이중 양성 방울에서 GzmB 신호에 대한 대표 히스토그램. (C) 시간 지점 및 NTD와 CAR T 세포 사이의 이중 양성 방울에서 PI 신호에 대한 대표 히스토그램. 모든 액적 측정은 강도 높이(H) 측정으로 수행됩니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67657/67657fig05large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67657/67657fig06.jpg"> 
그림 6: 내부 대조군 및 참조 모집단. (A) 그림 5A 의 4개 사분면 각각을 선택하고 GzmB 및 PI를 각각 측정했습니다. 이러한 유형의 정량화를 통해 T 세포 효능에 대한 최종 분석을 수행하기 전에 배경 신호를 측정하고 뺄 수 있습니다. (B) 4개의 액적 집단 각각에 대해 6시간 배양 후 빈도 GzmB 양성 액적을 보여주는 그래프로, Donor 1 CAR T 샘플의 데이터로 예시됩니다. (C) 배경 세포 사멸은 측정된 각 시점에서 측정된 각 시점에서 JeKo-1 단독 및 T 세포 단독 대조군 액적 집단에서 공여자 1의 데이터를 사용하여 결정되었습니다. 배경 세포 사멸은 그림 7에 나와 있고 3.3단계에서 설명한 살아있는 GzmB 분비 및 세포 사멸 효과기 세포의 빈도를 계산하는 데 사용됩니다. 약어: Pre = encapsulation. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67657/67657fig06large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67657/67657fig07.jpg"> 
그림 7: 이중 양성 액적에서 GzmB를 분비하고 JeKo-1 세포를 사멸시킬 수 있는 T 세포의 정량화. 2명의 기증자로부터 게이트된 이중 양성 액적을 액적에서 2시간, 4시간 및 6시간 동시 배양 후 검사했습니다. (A) GzmB를 분비하는 표적 세포와 조우하는 T 세포의 빈도 및 NTD T 세포와 CAR T 세포의 비교. (B) 함께 캡슐화된 표적 세포를 죽이는 표적 세포와 조우하는 T 세포의 빈도. 약어: GzmB = 그랜자임 B, NTD = 비형질도입, PI = 요오드화 프로피듐. * = P-값 &lt; 0.05, ** = P-값 &lt; 0.005, **** = 이원 분산분석에 의한 P-값 &lt; 0.0001. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67657/67657fig07large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

단일 세포 수준에서 키메라 항원 수용체 T 세포를 평가하기 위한 액적 기반 세포 독성 분석

The assessment of the cytotoxic potential of T cell-based therapies, such as chimeric antigen receptor (CAR) T cell treatments, is instrumental in ...

droplet-based-cytotoxicity-assay-to-assess-chimeric-antigen-receptor

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

이 비디오는 실시간 전기 임피던스 측정을 통해 암세포에 대한 CAR T 세포 활성을 모니터링하는 방법을 보여줍니다. 임피던스의 변화를 추적하면 암세포 세포 용해를 유도하는 CAR T 세포의 효과를 평가하여 세포 독성 능력에 대한 통찰력을 얻을 수 있습니다.

CAR T 세포의 효능을 평가하기 위한 실시간 체외 세포분해 분석

우리는 종양 대상 세포와 incubated 때 T 세포의 세포 독성을 측정 할 수있는 단일 셀 높은 처리량 분석을 설명합니다. 이 방법은 spatially 정의 비율에서 T 세포와 대상 세포를 한정하는 하위 nanoliter 우물 (~ 100,000 우물 / 배열)의 조밀 한, 탄성 배열을 사용하고 이펙터 - 대상 활용 및 후속 apoptosis를 모니터링하는 형광 현미경에 연결된다.

T 세포 양적 높은 처리량 단일 세포 세포 독성 분석

우리는 액체 및 고체 종양 세포를 표적으로 하는 키메라 항원 수용체 T 세포의 효능을 평가하기 위해 시험관내 세포분석 시스템을 정량적으로 실시간으로 기술한다. 이 프로토콜은 다른 면역 이펙터 세포뿐만 아니라 조합 치료를 평가하기 위해 확장 될 수있다.

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