Name: Open-Source Droplet Microfluidics를 이용한 플라스미드 안정성 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-12-27T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 43 s
Description: 배우세요 오픈소스 드롭릿 마이크로플루이딕스를 활용한 세균 플라스미드 안정성 분석 방법입니다. 형광 현미경으로 단일 세포 마이크로콜로니의 플라스미드 보유율을 정량화하여 전통적 배양법의 대안을 제공합니다.

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<ol><li>Wein, T., Hülter, N. F., Mizrahi, I., Dagan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emergence+of+plasmid+stability+under+non-selective+conditions+maintains+antibiotic+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Emergence of plasmid stability under non-selective conditions maintains antibiotic resistance.</a> Nat Commun. 10 (1), 2595(2019).</li>
<li>Rodríguez-Beltrán, J., DelaFuente, J., León-Sampedro, R., MacLean, R. C., Millán, ÁS. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beyond+horizontal+gene+transfer%3A+The+role+of+plasmids+in+bacterial+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Beyond horizontal gene transfer: The role of plasmids in bacterial evolution.</a> Nat Rev Microbiol. 19 (6), 347(2021).</li>
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<li>Rouches, M. V., Xu, Y., Cortes, L. B. G., Lambert, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+plasmid+system+with+tunable+copy+number%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">A plasmid system with tunable copy number.</a> Nat Commun. 13 (1), 3908(2022).</li>
<li>Silva, F., Queiroz, J. A., Domingues, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluating+metabolic+stress+and+plasmid+stability+in+plasmid+DNA+production+by+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Adv%22%5BJournal%5D)">Evaluating metabolic stress and plasmid stability in plasmid DNA production by Escherichia coli.</a> Biotechnol Adv. 30 (3), 691-708 (2012).</li>
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<li>Moragues, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Droplet-based+microfluidics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Methods+Primers%22%5BJournal%5D)">Droplet-based microfluidics.</a> Nat Rev Methods Primers. 3 (1), 32(2023).</li>
<li>Vitalis, C., Wenzel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leveraging+interactions+in+microfluidic+droplets+for+enhanced+biotechnology+screens%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Leveraging interactions in microfluidic droplets for enhanced biotechnology screens.</a> Current Opinion in Biotechnology. 82, 102966(2023).</li>
<li>Sinha, N., Subedi, N., Wimmers, F., Soennichsen, M., Tel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+pipette-tip+based+method+for+seeding+cells+to+droplet+microfluidic+platforms%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A pipette-tip based method for seeding cells to droplet microfluidic platforms.</a> J Vis Exp. (144), e57848(2019).</li>
<li>Wenzel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Open+hardware%3A+From+DIY+trend+to+global+transformation+in+access+to+laboratory+equipment%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Biol%22%5BJournal%5D)">Open hardware: From DIY trend to global transformation in access to laboratory equipment.</a> PLOS Biol. 21 (1), e3001931(2023).</li>
<li>Murillo, L. F. R., Wenzel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Welcome+to+the+journal+of+open+hardware%5BTitle%5D)+AND+%22J+Open+Hardware%22%5BJournal%5D)">Welcome to the journal of open hardware.</a> J Open Hardware. 1 (1), (2017).</li>
<li>Shin, J. H., Choi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Open-source+and+do-it-yourself+microfluidics%5BTitle%5D)+AND+%22Sens+Actuators+B+Chem%22%5BJournal%5D)">Open-source and do-it-yourself microfluidics.</a> Sens Actuators B Chem. 347, 130624(2021).</li>
<li>Pryszlak, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enrichment+of+gut+microbiome+strains+for+cultivation-free+genome+sequencing+using+droplet+microfluidics%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep+Methods%22%5BJournal%5D)">Enrichment of gut microbiome strains for cultivation-free genome sequencing using droplet microfluidics.</a> Cell Rep Methods. 2 (1), 100137(2021).</li>
<li>Pollak, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Universal+loop+assembly%3A+open%2C+efficient+and+cross-kingdom+DNA+fabrication%5BTitle%5D)+AND+%22Biology%22%5BJournal%5D)">Universal loop assembly: open, efficient and cross-kingdom DNA fabrication.</a> Biology. 5 (1), (2020).</li>
<li>Volkmer, B., Heinemann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Condition-dependent+cell+volume+and+concentration+of+Escherichia+coli+to+facilitate+data+conversion+for+systems+biology+modeling%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Condition-dependent cell volume and concentration of Escherichia coli to facilitate data conversion for systems biology modeling.</a> PLoS ONE. 6 (7), e23126(2011).</li>
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<li>Lau, B. T. C., Malkus, P., Paulsson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+quantitative+methods+for+measuring+plasmid+loss+rates+reveal+unexpected+stability%5BTitle%5D)+AND+%22Plasmid%22%5BJournal%5D)">New quantitative methods for measuring plasmid loss rates reveal unexpected stability.</a> Plasmid. 70 (3), 353-361 (2013).</li>
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</ol>

<table><tbody><tr><td>1H,1H,2H,2H-퍼플루오로-1-옥탄올</td><td>시그마-알드리치</td><td>370533-25G</td><td>에멀젼 파괴용</td></tr><tr><td>70% 에탄올</td><td></td><td></td><td>세포 투과용</td></tr><tr><td>한천-한천</td><td>윙클러</td><td>9002-18-0</td><td></td></tr><tr><td>생검 펀치</td><td></td><td></td><td>0.75mm 및 1.8mm</td></tr><tr><td>파란색 LED 트랜스일루미네이터</td><td>IO 로데오</td><td></td><td></td></tr><tr><td>배양 튜브</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>진공 펌프가 있는</td>15mL<td>데시케이터</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PDMS 혼합용</td><td>일회용 컵</td><td></td><td></td> PDMS</tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr> 대<tr><td>장균 TOP10 균주</td><td></td><td></td><td></td></tr> 혼합용 <tr><td>FluoPi 현미경</td><td>https://github.com/wenzel-lab/FluoPi</td><td></td><td>플레이트 분석용 녹색 형광 이미징 시스템</td></tr><tr><td>불소화 오일</td><td>3M</td><td></td><td>Novec 7500</td></tr><tr><td>유리 슬라이드 히터</td><td>https://github.com/wenzel-lab/modular-microfluidics-workstation-controller/tree/master/module-heating-and-stirring</td><td></td><td>40 &deg에서 온도를 제어하기 위해; 미세유체 칩</td></tr><tr><td>유리 슬라이드</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>핫플레이트</td><td>정비</td><td></td>사 증<td>발용 Aquapel</td></tr><tr><td>이미지 분석 소프트웨어</td><td>Fiji/ImageJ</td><td></td><td>2.14.0/1.54f</td></tr><tr><td>인큐베이터</td><td>Mundo Lab</td><td></td><td>MLAB Scientific / 플레이트 및 마이크로겔 배양용&nbsp;</td></tr><tr><td>이소프로판올</td><td></td><td></td><td>유리 슬라이드 세척용</td></tr><tr><td>카나마이신</td><td></td><td></td><td>100 ug/mL 농도</td></tr><tr><td>L자형 스프레더</td><td></td><td></td> 한<td>천 플레이트에 박테리아 퍼짐 마스터</td></tr><tr><td>몰</td><td></td><td></td>드 <td>실리콘 또는 유리 웨이퍼의 칩 디자인</td></tr> 마이크로<tr><td>튜브</td><td></td><td></td><td>2mL</td></tr><tr><td>NaCl 용액</td><td></td><td></td><td>나트륨 염화물 0.9% w/v</td></tr><tr><td>오픈 소스 하드웨어 스트로브 강화 현미경 스테이지</td><td>https://github.com/wenzel-lab/flow-microscopy-platform</td><td></td><td>명시야 현미경용</td></tr><tr><td>페트리 접시</td><td>Citotest</td><td>2303-1090</td><td>90 x 15 mm</td></tr><tr><td>피펫 팁 히터</td><td>https://github.com/wenzel-lab/modular-microfluidics-workstation-controller/tree/master/module-heating-and-stirring</td><td></td><td>40 &deg에서 온도를 제어하기 위해; 피펫 팁의 C 플라</td></tr><tr><td>즈마 클리너</td><td>Diener 전자</td><td>117056</td> 유리 <td>슬라이드와 PDMS 접착용</td></tr> 플라<tr><td>스미드 pCA_Odd1</td><td></td><td></td><td>sfGFP 및 카나마이신 저항성</td></tr><tr><td>폴리테트라플루오로에틸렌(PTFE) 튜브</td> 인코딩 <td>Adtech Polymer Engineering Ltd</td><td></td><td></td></tr><tr><td>사전 혼합 Luria Bertoni 배지</td><td>미국 생물 생명 과학</td><td>L1520</td><td></td></tr><tr><td>Propidium 요오드화물(PI)</td><td></td><td></td><td>염색용</td></tr><tr><td>라즈베리 파이 기반 압력 및 유량 컨트롤러 시스템</td><td>https://github.com/wenzel-lab/modular-microfluidics-workstation-controller</td><td></td><td>압력 및 유량 제어용</td></tr><tr><td>실리콘 엘라스토머 베이스</td><td>Sylgard</td><td></td><td>PDMS 키트 - 184 실리콘 엘라스토머 키트</td></tr> 실리콘 <tr><td>엘라스토머 경화제</td><td>Sylgard</td><td></td><td>PDMS 키트 - 184 실리콘 엘라스토머 키트</td></tr><tr>흡<td>광도 측정용</td><td>분광 광도계</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SQUID 현미경</td><td>https://github.com/wenzel-lab/SQUID-bioimaging-platform</td><td></td><td>염색 세포 분석을 위한 다중 형광 이미징 시스템</td></tr><tr><td>멸균 루프</td><td></td><td></td><td>콜로니 선택 및 줄무늬 도금 계</td></tr><tr><td>면 활성제</td><td>구체 유체 Pico-Surf</td><td></td><td></td></tr> 주<tr><td>사기</td><td>NIPRO</td><td></td><td>필터 및 튜브 포함</td></tr><tr><td>온도 제어 셰이커</td><td>Mundo Lab</td><td></td><td>DLAB HCM100-Pro</td></tr><tr><td>핀셋</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>초저겔화 온도 아가로스</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2576-5G</td><td>하이드로겔 비드 생성용</td></tr> 발<tr><td>수액(플루오로알킬 실란)</td><td>Aquapel</td><td></td><td>치료용 PDMS 장치의 마이크로채널</td></tr></tbody></table>

open-source droplet microfluidics를 이용한 플라스미드 안정성 분석

Plasmid Stability Analysis with Open-Source Droplet Microfluidics

cell encapsulation 및 microcolony formation의 검증
세포 캡슐화는 에멀젼을 분해하고 마이크로겔을 세척하기 전에 겔 미세방울에 대해 명시야 현미경 검사를 수행하여 육안으로 확인할 수 있습니다. 이 단계에서 에멀젼의 대표적인 결과는 그림 4에 나와 있습니다.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67659/67659fig4.jpg"> 
그림 4: 형광 현미경 검사 오버레이 이미지의 단면. 하룻밤 배양 후, 겔 미세방울 내부에서 E. coli 집락을 발현하는 sfGFP의 대표적인 미세군집체. 10배 배율과 0.30 NA의 현미경 대물렌즈를 사용했습니다. 눈금 막대 : 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67659/67659fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
이미지 분석 결과
마이크로겔이 염색되고 명시야가 지정되고 여러 위치에서 형광 채널이 획득되면 원본 이미지에서 음성으로 식별된 콜로니를 시각화할 수 있습니다( 그림 5A 참조). 한 실험의 모든 이미지에서 추출한 데이터를 플롯하여 다양한 콜로니의 형광 비율을 보여주고 플라스미드로 인코딩된 형광을 잃은 콜로니를 강조할 수 있습니다( 그림 5B 참조). 결과는 총 2785개의 분석된 마이크로 콜로니에서 100개의 콜로니가 플라스미드 또는 플라스미드 기능을 상실했으며, 이는 3.6%에 해당함을 나타냅니다.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67659/67659fig5.jpg"> 
그림 5: negative microcolonies의 정량화. (A) 형광 현미경 검사 오버레이 이미지의 단면. 기름 제거 및 염색 후, sfGFP를 발현하는 마이크로겔의 대표적인 콜로니와 두 개의 음성 콜로니는 DNA 염색의 적색 형광(검은색 원으로 표시)을 보여주었습니다. 눈금 막대: 100μm. (B) 16개의 다중 채널 현미경 이미지에서 추출한 개별 미세군집의 형광 값의 산점도. 녹색 형광이 없는 집락은 그래프에서 빨간색으로 표시된 것처럼 음성으로 계산되었습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67659/67659fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
한천 플레이트 정량화
삼중 플레이트의 이미지는 그림 6에 나와 있으며, 비형광 콜로니는 흰색 화살표로 표시됩니다. 첫 번째 플레이트(그림 6A)에는 총 213개의 콜로니가 표시되었으며 그 중 1개는 형광이 아니었습니다. 두 번째 플레이트(그림 6B)에는 총 49개의 콜로니가 있으며 비형광 콜로니가 없습니다. 세 번째 플레이트(그림 6C)는 총 252개의 콜로니를 보여주었으며 그 중 6개는 형광이 아니었습니다. 이러한 결과는 평균 콜로니 플라스미드 손실률 2.3%에 해당하며, 표준 편차는 3.2입니다.
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67659/67659fig6.jpg"> 
그림 6: 플레이트의 음성 콜로니 식별. (가-씨) LB-한천 플레이트의 형광 및 비형광 대장 균 집락(직경: 90mm, 높이: 15mm). -80°C 스톡에서 sfGFP를 함유한 대장 균에서 유래한 접종물을 1일째에 줄무늬를 만들고, 2일째에 항생제로 배양하고, 3일째부터 6일까지 매일 1:100씩 희석하여 플라스미드 손실을 허용했습니다. 콜로니를 37°C에서 24시간 동안 배양하고 FluoPi 챔버에서 이미지화했습니다. 비형광 집락은 김프로 강화되고 흰색 화살표로 표시되었습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67659/67659fig6large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

Open-Source Droplet Microfluidics를 이용한 플라스미드 안정성 분석

Plasmids play a vital role in synthetic biology by enabling the introduction and expression of foreign genes in various organisms, thereby facilitating ...

plasmid-stability-analysis-with-open-source-droplet-microfluidics

Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

Microfluidic 장치는 실시간으로 적절한 물리적인 비늘에서 복잡한 자연의 프로세스를 시각화하는 데 사용할 수 있습니다. 우리는 표면 하의에 박테리아의 성장과 교통 수단을 공부하고 자연 다공성 매체의 주요 기능을 모방한 것이었 간단한 microfluidic 장치를 개발했습니다.

다공성 매체에서 미생물 교통 유학에 대한 간단한 Microfluidic 시스템 : 미생물의 창

그들은 kHz에서 속도 저렴 picoliter, 자기들에게만 혈관을 생성할 수 있기 때문에 비말 기반 microfluidic 플랫폼은 높은 처리량 실험을위한 유망한 후보자 있습니다. 빠르고, 민감하고 고해상도 형광 spectroscopic 방법과의 통합을 통해 이러한 시스템 내에서 발생하는 정보의 다량은 효율적으로 추출 무력화하고 이용하실 수 있습니다.

microfluidic 비말 플랫폼 형광 검출 방법

우리는 클린 룸이나 부드러운 리소그래피 필요없이 여러 독특한 변종에 유사한 동적 조건을 적용 할 수있는 마이크로 유체 장치를 생산하는 간단한 방법을 제시한다.

여러 고유 긴장 유학을위한 마이크로 유체 장치

출처: 헤머리히 J. 외 자동화된 미생물반응기 기술을 이용한 이종 단백질 생산 최적화 프로토콜. J. Vis. 경험 (2017).이 영상은 다양한 배지 제형에 반응하여 박테리아 성장과 형광 단백질 분비를 모니터링하기 위해 자동화된 미생물 반응기를 사용하는 방법을 시연합니다. 분비성 형광 단백질을 발현하는 유전자 변형 박테리아는 항생제 선별 하에 배양되어 영양분이 다양한 웰에 접종됩니다. 세포 밀도와 형광의 실시간 광학 측정은 다양한 성장 조건에서 단백질 생산을 비교 분석할 수 있게 합니다.

자동화된 미생물반응기를 이용한 다양한 배지 제형에서 박테리아 성장 모니터링

이 프로토콜에서는 원핵 생물의 단일 세포 분석을 위한 미세유체 피콜리터 생물반응기(PLBR)의 제작, 설정 및 기본 작동이 소개됩니다. 산업적으로 관련된 미생물을 원리 증명으로 분석하여 기존 방법으로는 거의 불가능했던 특정 기간 동안의 성장 속도, 형태 및 표현형 이질성에 대한 통찰력을 얻을 수 있었습니다.

미생물 단일 세포 분석을 위한 미세유체 피콜리터 바이오리액터: 제작, 시스템 설정 및 작동

우리는 단순화된 (아날로그) 판독으로 핵산을 정량화하기 위한 종말점 디지털 분석을 설명합니다. 당사는 특수 기기가 아닌 표준 qPCR 기계를 사용하여 액적 기반 디지털 분석의 벌크 형광을 측정하고 현미경 검사로 결과를 확인합니다.

디지털 핵산 정량 분석​​ 실험의 단순 대량 판독

이 작품에는 미세 물방울 기반 플랫폼의 제조와 스피어 PCR 확대를 위한 polyacrylamide 스피어의 응용 프로그램에 대 한 방법을 제공 한다. 스피어 PCR 방법 단일 가닥 DNA amplicons 이중 가닥 DNA를 분리 하지 않고 얻을 수 있습니다.

드롭릿 기반 미세 접근 및 단일 가닥 DNA Amplicons 위한 스피어 PCR 증폭

우리의 실험적인 접근은 세균성 인구에 있는 plasmid 풍부하고 항생 저항을 시간이 지남에 따라 전략을 제공합니다.

실험적 진화 접근법에서 플라스미드 매개 항생제 내성의 정량화

프로토콜의 전반적인 목표는 세포 없는 단백질 합성에 사용될 수 있는 1cm2 평면 기판에 1백만 개 이상의 주문, 균일, 안정 및 생체 호환 펨토리터 물방울을 준비하는 것입니다.

단일 DNA 분자에서 대규모 병렬 단백질 합성을 위한 펨토리터 물방울 배열

여기에서는 수중수(water-in-oil) 에멀젼(플러그)의 조합 라이브러리를 생산하기 위한 폴리디메틸실록산(PDMS) 기반 이중층 장치의 제조를 소개합니다. 플러그 생산을 자동화하는 데 필요한 하드웨어 및 소프트웨어는 프로토콜에 자세히 설명되어 있으며 형광 플러그의 정량적 라이브러리 생산도 시연됩니다.

조합 플러그 생산을 위한 이중층 미세유체 장치

이 프로토콜은 산업 미생물을 위한 표준 고처리량 스크리닝 워크플로우를 제공합니다. 이 과정은 ARTP 돌연변이 유발을 통해 돌연변이 라이브러리를 구축하고, 자동화된 마이크로플루이딕스를 이용한 양성 액상 스크리닝을 수행하며, 이후 결과를 검증하는 과정을 포함합니다. 이 워크플로우의 신뢰성은 고수율 B. coagulans 균주를 스크리닝하여 검증되었습니다.

자동 액상 마이크로플루이딕 플랫폼을 이용한 L-락산을 과생산하는 바실루스 응고 체 돌연변이체의 고처리량 스크리닝

배우세요 오픈소스 드롭릿 마이크로플루이딕스를 활용한 세균 플라스미드 안정성 분석 방법입니다. 형광 현미경으로 단일 세포 마이크로콜로니의 플라스미드 보유율을 정량화하여 전통적 배양법의 대안을 제공합니다.

Open-Source Droplet Microfluidics를 이용한 플라스미드 안정성 분석

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