쥐의 폐에 액체를 전달하기 위한 개선된 방법론: 소비자 검이경을 사용한 삽관

[아나운서] 마우스 폐로의 액체 전달을 위한 개선된 방법론. 소비자 검이경을 사용한 삽관. 모든 동물 절차와 이 내용은 Tulane University 비교 의학과에서 검토했으며 프로토콜 1810에서 승인되었습니다. 계속하기 전에 IACUC 승인을 구하고 해당 기관의 수의사와 상담하십시오. 새로운 폐 치료제의 개발은 마우스 폐로의 안정적이고 반복 가능한 전달에 의존하지만 전통적으로 비강내 투여, 혀 전체에 의한 구인두 흡인 또는 외과적 절단에 의존해 왔습니다. 다음 방법은 혀가 가득 찬 것에 비해 변동성을 줄여 더 작은 동물 코호트를 허용합니다. 또한 컷다운보다 훨씬 덜 침습적입니다. 절차, 1단계, 설정. 설치류 삽관 키트는 처음에 삽관 안전 쐐기가 있는 선박을 사용했습니다. 이들은 20게이지, 1인치 플렉시블 카테터에 맞는 작은 원추형 슬리브입니다. 카테터가 용골을 손상시키는 것을 방지합니다. 사용하기 전에 이소프로판올 준비 패드로 안전 쐐기를 청소하십시오. 깨끗한 안전 웨지(여기 녹색)를 20게이지 플렉시블 캐뉼라에 밀어 넣습니다. 상업용 검이경, 휴대폰, 노즈콘이 있는 마우스 스탠드, 구부러진 미세한 톱니 모양의 겸자, 기관내관, 광섬유 조명(사용하는 경우) 등 필요한 기타 도구를 모으십시오. 사용하기 전에 이소프로판올 준비 패드로 이 모든 것을 청소하십시오. 약 20cm 길이의 유연한 튜브를 가져 가십시오. U자형으로 구부리고 한쪽 끝에 미끼 잠금 연결을 추가합니다. 트위스트 타이로 U자형을 고정합니다. 튜브에 2-300마이크로리터의 멸균 여과수 또는 인도 잉크를 추가합니다. 이하 이 어셈블리를 버블 튜브라고 합니다. 13cm의 사이즈 0 등급 실크 봉합사를 원으로 묶어 봉합 고리를 잡습니다. 이 고리를 마우스 스탠드 상단에 놓고 봉합사의 양쪽이 잘 고정되었는지 확인합니다. 금속 돋보기 베이스 위에 마우스 스탠드를 놓습니다. 마우스의 입이 있는 곳에 도움의 손을 배치합니다. 유도 챔버에 마우스를 놓습니다. 분당 0.8리터의 일정한 유량 산소와 2% 이소플루란을 사용하십시오. 노즈콘을 배치하는 동안 깨어나지 않도록 마우스를 충분히 마취합니다. 마우스의 호흡수를 크게 억제하지 마십시오. 규칙적인 호흡은 성대를 감상하는 데 도움이 됩니다. 검이경을 휴대폰에 연결하고 비디오 피드가 안정적인지 확인하십시오. 주의, 이 절차 중 연구원의 이소플루오란 노출을 최소화하려면 이 방법으로 여러 번 삽관하거나 훈련을 수행하는 경우 화학 호흡기를 사용하십시오. 또는 몇 개의 나무에서 절차를 수행하십시오. 두 번째 단계, 동물 병기 결정. 첫 번째 동물이 잠들자마자 유도실에서 데려갑니다. 그들을 목덜미로 만들고 봉합사 길이에 윗니를 놓습니다. 마우스를 스탠드에 다시 놓는 동안 봉합사의 위치를 유지하기 위해 동물에게 가벼운 장력을 가합니다. 목 각도를 약간 뒤로 조정하여 목을 5도에서 15도 약간 확장합니다. 코콘을 콧구멍 위로 부드럽게 밀어 넣습니다. 마우스를 매달아 있는 봉합사를 방해할 수 있으므로 노즈콘을 세게 아래로 누르지 마십시오. 크고 미세하게 톱니 모양의 구부러진 집게를 사용하여 혀를 아랫입술에 최대한 가깝게 단단히 잡습니다. 위쪽 치아에서 아래쪽 치아 옆으로 단단히 당겨 당깁니다. 주의, 장기간 견인, 과도한 긴장 또는 혀를 짓누르는 것은 동물의 건강을 해칠 수 있습니다. 혀의 멍, 출혈, 부기 또는 건조를 포함한 외상의 징후를 모니터링하십시오. 관찰된 경우 절차를 중단하고 수의사에게 알립니다. 도움의 손을 사용하는 경우 이 위치에서 집게를 지지하십시오. 삽관 안전 쐐기가 제자리에 있는 유연한 카테터를 통해 사용하는 경우 광섬유 조명을 공급합니다. 3단계, 성대와 삽관의 시각적 감상. 주로 사용하지 않는 손에 검이경을 들고 혀를 가볍게 누릅니다. 그런 다음 카메라와 광원의 각도를 조정하여 혀 밑 부분 근처의 성대를 시각화합니다. 해부학적 구조와 조직 색상의 약간의 변화로 인해 호흡과 관련된 움직임을 사용하여 구조적 식별을 확인하십시오. 처음 시작할 때 비디오 피드에서 방향을 잡는 것이 어려울 수 있습니다. 이것이 거짓 성대입니다. 이것이 진정한 성대입니다. 이것은 협측 조직의 반사입니다. 이것은 프로브와 광섬유 조명입니다. 이것이 후두개입니다. 이것이 연구개입니다. 이것은 삽관의 대상인 rima glottidis입니다. 이것은 혀를 누르는 검이경 입술입니다. 이곳은 출입 금지 지역입니다. 광섬유 조명을 켠 상태에서 사용하는 경우 검이경과 함께 캐뉼라를 공급하여 혀 밑 부분이나 검이경의 입술 부분에 가볍게 접촉시킵니다. 참고로 카테터의 접근 각도를 매우 얕게 조정하십시오. 카테터를 삽입한 직후 성대를 지나 1mm 미만 떨어진 곳에서 카테터 끝을 들어 올려 벤치 상단과 거의 평행이 되도록 합니다. 이것은 후두개가 카테터를 식도로 등쪽으로 밀어 넣는 것을 방지합니다. 카테터를 전진시킬 때 저항이 거의 없어야 합니다. 저항이 발생하면 즉시 카테터를 제거하고 호흡이 정상으로 돌아올 수 있도록 하십시오. 출혈이 관찰되면 수의사와 상담하십시오. 4단계, 기관내관 배치 확인. 검이경을 사용하여 튜브가 올바른 위치에 있는지 육안으로 확인하는 것 외에도 기관은 식도보다 배치 중 저항이 적습니다. 광학적 삽입 깊이는 성대 너머로 약 5mm입니다. 빛은 삽입 깊이가 적절한지 확인하는 2차 방법으로 목을 통해 볼 수 있습니다. 삽관 안전 쐐기는 기관내관 배치의 과도한 깊이를 방지해야 합니다. 안전 쐐기는 코리나의 외상을 방지하지만 전진을 방해할 필요는 없습니다. 그런 다음 기관내관을 제자리에 고정한 상태에서 광섬유 조명을 제거합니다. 버블 튜브 방법을 사용하여 카테터의 적절한 배치를 확인하십시오. 하단 잠금 장치를 사용하여 버블 튜브를 제자리에 고정합니다. 일회 호흡량은 즉시 명백해야 합니다. 그렇지 않으면 기관내관이 잘못 배치된 것입니다. 빠르게 제거하고 마우스의 정상적인 호흡수가 돌아올 수 있도록 하십시오. 5단계, 기관내 전달. 구인두 분만을 위한 혀 당기기 방법과 마찬가지로 삽관을 통한 분만은 동물을 익사시킬 위험이 있습니다. 청소년 및 성인 마우스에서 50마이크로리터는 일반적으로 전달하기에 안전한 양의 체액이며 폐 전체에 퍼지기에 충분합니다. 투여를 위해 피펫을 사용하는 경우 원하는 부피를 카테터에 직접 피펫팅하고 마우스가 용액을 흡입하도록 합니다. 폐로의 확산 전달과 최대 500마이크로리터의 공기와 함께 폐로 전달된 액체를 보장합니다. 원하는 경우 전달된 액체의 음의 흡인을 위험에 빠뜨리지 않고 파이퍼를 여러 번 낮추는 작업을 수행할 수 있습니다. 접종물을 공기로 세척할 때 일회 호흡량(약 200마이크로리터) 이상을 사용해야 할 수 있습니다. 그러나 500마이크로리터를 사용해도 폐활량의 절반 정도에 불과하기 때문에 외상의 위험이 없습니다. 6단계, 전달 평가. 휴대용 광섬유 조명은 저렴하고 쉽게 구할 수 있는 구성 요소로 만들 수 있습니다. 여기에 표시된 대로 상업용 광섬유 어셈블리를 사용할 수 있습니다. 그러나 50mm 플라스틱 광섬유 케이블이 공급되는 20게이지 바늘을 사용하여 구멍이 뚫린 75ml 원추형 튜브 뚜껑으로 충분합니다. 이 비디오에는 상업용 장치와 수제 장치가 모두 사용되었습니다. 대표적인 결과로, 삽관을 이용한 기관내 전달은 혀를 당기는 구인두 흡인과 비교할 때 전달이 개선되고 변동성이 감소합니다. 혀 당기기와 유도 삽관의 직접 비교. 경험이 묻혀 있거나 50마이크로리터의 희석된 인도 잉크를 혀를 당겨 구인두로 독립적으로 전달하도록 요청받은 세 명의 다른 조사관이 남녀 모두 10-12주 된 C57 BL/6J 마우스에게 혀를 당기고 구인두로 전달하도록 요청했습니다. 두 명의 연구원은 또한 설명된 대로 삽관을 통해 동일한 양의 잉크를 폐에 전달했습니다. 폐는 분만 직후 제거하여 2배 배율로 촬영했습니다. 사진은 이미지 J를 사용하여 독립적인 맹검 연구원이 염색한 영역에 대해 평가했습니다. 그녀는 삽관을 사용하면 더 많은 폐 부위가 얼룩진다는 것을 발견했습니다. 또한, 평균으로부터의 백분율 편차로 표현되는 변동성은 혀를 당기는 것이 아니라 삽관 후 기관내 전달을 사용하는 경우 감소했습니다. 유도 삽관에 사용되는 이 스테이션은 그림과 같이 준비됩니다. 왼쪽부터 분만용 피펫, 적절한 기관내관 배치 확인을 위한 버블 튜브, 겸자, 주걱, 소아 비강 검경, 도움의 손, 확대등, 노즈콘이 있는 마우스 스탠드, 광섬유 프로브 및 마취 유도 챔버. 삽관은 OP 흡인에 비해 변동성이 적고 폐에 더 많이 전달됩니다. 10주령 암컷 판막 C 마우스에게 AIV 6.2 루시페라아제의 10 내지 11번째 VG를 1회 투여하고 7일 후 생체 내 생물발광 영상으로 평가하였다. 영상 촬영 10분 전에 루시페린을 피하 주사했습니다. 혀를 당기거나 삽관에 의한 기관내 설치 후 OP 흡인으로 AV 6.2 루시페라아제를 투여받은 마우스의 대표적인 a-vis 이미지가 표시됩니다. 혀를 당기는 구인두 흡인은 상기도의 여러 부분에 신호가 분포된 반면, 삽관은 폐에 신호가 집중되었습니다. 관심 영역은 동일한 영역이며 영역 내의 평균 광도가 이미지에 표시됩니다. 루시페라제 신호의 정량화는 삽관에 의한 폐로의 전달 효율성이 향상되었고 이 방법을 사용한 전달의 변동성 감소를 더욱 강조했습니다. 결론, 이전 그림에서 볼 수 있듯이 전통적인 혀 당기기 방법을 사용한 폐간 접종은 고르지 않고 일관되지 않은 접종 분포와 폐에 도달하는 양의 더 큰 변동성을 보여줍니다. 대조적으로, 삽관 방법은 오른쪽 및 왼쪽 폐 모두에 보다 일관된 전달을 가능하게 했으며 가변성이 적었습니다. 이 삽관 방법의 강력하게 입증된 긍정적인 결과는 첫째, 마우스 폐에 최대 50마이크로리터의 복제 가능한 설치, 둘째, 폐 전체에 주입된 액체의 확산 분포, 셋째, 폐 너머로 접종물의 확산 감소입니다. 이 방법은 빠르고 안전하며 값비싼 장비나 시간 집약적인 교육 없이 실험실 절차에 통합할 수 있습니다.